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[研究背景]中国每年有大约35,000个病例被确诊为非小细胞肺癌,而一旦确诊之后的五年生存率只有17.9%。目前早期非小细胞肺癌可以通过手术治愈。但是,由于早期症状不典型和缺乏合适的诊断工具,大多数患者确诊时已经处于IIIB或IV期,不再适合手术治疗。很多患者还出现远处转移,只能通过靶向治疗或者化疗延长生存时间。但是,由于获得性耐药的发生,化学治疗的治疗效果越来越受到限制。为了解决肿瘤化疗耐药的难题,全世界科研人员投入了大量的资源及精力,并取得了丰硕的成果。最近,长链非编码RNA(lncRNAs)进入了研究人员的视线,被认为参与了肿瘤化疗耐药过程。人类基因组中大约有75%的基因为非编码RNA。它们虽然不编码蛋白质,但是通过多种机制参与基因表达调控及细胞的生物学行为。近年来,lncRNA已经被证实参与了肿瘤发生、发展的各个重要阶段,然而其在化疗耐药中的发挥的作用及机制仍然不清楚。之前,我们实验室通过高通量表达谱芯片在非小细胞肺癌多西他赛耐药株中筛选出一批表达差异较大的lncRNA和m RNA分子。本研究通过分析芯片结果,发现lncRNA PDLIM5与非小细胞肺癌多西他赛耐药密切相关,并通过体外实验验证了这一点。之后,通过芯片数据及生物信息学分析发现了PDLIM5通过mi R-200b作用于下游靶分子SLC7A11,从而调控细胞的铁死亡,引起非小细胞肺癌细胞对于多西他赛的耐药。[研究目的]1、筛选出与非小细胞肺癌耐药有关的lncRNA及m RNA分子。2、通过体外实验验证lncRNA PDLIM5对非小细胞肺癌多西他赛耐药具有调控作用。3、进一步探究PDLIM5调控非小细胞肺癌多西他赛耐药的分子机制[研究方法]1、CCK8实验测得非小细胞肺癌多西他赛耐药株及相应亲本株对于多西他赛的IC50值,验证耐药株对于多西他赛存在耐药性。2、根据高通量表达谱芯片结果,选出表达差异较大的lncRNA及m RNA分子,并利用qRT-PCR、Western Blot实验验证目标分子在亲本株及耐药株的表达水平。3、使用慢病毒过表达/干扰PDLIM5在细胞中的表达,CCK8实验验证PDLIM5对于非小细胞肺癌细胞株对多西他赛敏感性的影响,集落形成实验验证其对于非小细胞肺癌细胞增殖能力的影响。4、通过ROS/Superoxide Detection Assay试剂盒验证亲本株和耐药株经化疗药物处理后细胞的铁死亡水平,过表达/干扰PDLIM5后细胞铁死亡水平的变化情况。5、通过生物信息学分析预测同时与PDLIM5和SLC7A11作用的mi RNA,使用mimics/inhibitor验证其对下游分子的影响。[结果]测得耐药株对于多西他赛的IC50是亲本株的30余倍。通过高通量芯片筛选,亲本株与耐药株中表达差异超过15倍的lncRNA 12条,表达差异超过10倍的lncRNA 38条。蛋白编码基因m RNA芯片结果表明:亲本株与耐药株中表达差异超过20倍的m RNA共14条,表达差异超过10倍的m RNA 11条。qRT-PCR验证耐药株中PDLIM5表达水平是亲本株中2倍。通过GO、Pathway分析结合芯片测序结果,发现lncRNA PDLIM5与铁死亡通路关键蛋白SLC7A11的m RNA表达正相关,且通过qRT-PCR、Western Blot实验验证耐药株中SLC7A11表达水平与亲本株相比较高。分别在亲本株中增加PDLIM5的表达以及在耐药株中降低PDLIM5的表达,发现PDLIM5与非小细胞肺癌细胞对于多西他赛的敏感性、增殖能力负相关,且正向调控SLC7A11表达水平。经多西他赛处理后,亲本株的铁死亡水平明显高于耐药株,但当过表达PDLIM5后,亲本株的铁死亡水平随之下降。同样,干扰耐药株中PDLIM5表达后,耐药株铁死亡水平上升。通过miRNA靶基因在线分析软件预测PDLIM5及SLC7A11序列上存在mi R-200b潜在结合位点。过表达PDLIM5后mi R-200b表达水平下降,而干扰PDLIM5则mi R-200b表达水平上升。mi R-200b mimics可以降低SLC7A11表达,而mi R-200b inhibitor可以升高SLC7A11表达。[结论]PDLIM5在非小细胞肺癌多西他赛耐药株中表达增高,通过mi R-200b调控细胞表面膜蛋白SLC7A11表达。SLC7A11是铁死亡通路的关键蛋白,它的表达升高可以降低化疗之后肿瘤细胞的铁死亡水平,从而引起对于多种化疗药物的耐药。综上所述,本研究将非小细胞肺癌多西他赛耐药lncRNA表达谱和m RNA表达谱数据整合分析,结合生物信息学分析方法,解释PDLIM5/mi R-200b/SLC7A11信号轴在非小细胞肺癌多西他赛耐药形成中的调节作用,为逆转非小细胞肺癌化疗耐药提供新的思路。