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甜菜M14品系是通过二倍体栽培甜菜(Beta vulgaris L.)和野生白花甜菜(Beta corolliflora Zoss.)进行种间杂交及回交,在其后代中筛选出的附加了白花甜菜9号染色体的单体附加系,附加的染色体平均传递率为96.5%。M14品系具有兼性无融合生殖的特性,是克隆无融合生殖相关基因极其难得的实验材料。本实验室前期通过抑制消减杂交技术(suppression subtractive hybridization,SSH)和RACE技术得到了甜菜M14特异表达基因BvM14-MADSbox的cDNA全长。通过生物信息学分析以及该基因在转基因烟草中的组成型表达已初步证实BvM14-MADSbox基因属于MADS-box基因家族,在植物花各轮器官的分化发育及调控花期中起作用。由于MADS-box基因在植物体生长发育过程中起到重要的调控作用,而且它在植物体不同的发育阶段有不同的时空表达模式,如果利用转基因研究中载体常用的组成型启动子35S驱动BvM14-MADSbox基因在植物各组织中恒定持续的表达,不能从时间和空间上进行有效调控,会存在一些缺陷。因此,为进一步深入研究BvM14-MADSbox基因的功能以期揭示该基因的表达特性,克隆出其启动子具有十分重要的意义,它可为今后分析BvM14-MADSbox基因表达调控机制以及利用BvM14-MADSbox自身特有的启动子调控该基因在转基因植物中表达,从而突破外源基因组成型表达的局限奠定基础。本研究利用染色体步移的方法从甜菜M14品系基因组DNA中克隆到BvM14-MADSbox基因起始密码子上游1 870bp的序列。通过在线分析软件http://www.fruitfly.org/seq_tools/promoter.html对该序列分析,预测出转录起始位点为A,位于起始密码子上游152bp处。通过Plant CARE http://bioinformatics.psb. ugent.be/ webtools/plantcare/html/在线分析,BvM14-MADSbox启动子中含有的顺式作用元件,结果表明该序列中除了包括TATA-box、CAAT-box等典型的真核生物顺式调控元件外,还含有ARE、ABRE、ERE等重要的顺式调控元件和一些光反应相关的元件以及抗寒抗旱诱导元件。进一步通过PCR的方法扩增了4个BvM14-MADSbox启动子5′缺失片段,分别命名为p1700、p1200、p700和p300。将4个缺失片段分别替换植物表达载体pBI121上的35S启动子,构建了4个以GUS为报告基因的缺失表达载体,分别为pBI-p1700,pBI-p1200,pBI-p700和pBI-p300。利用农杆菌介导的叶盘法将4个缺失表达载体转化烟草叶片。GUS基因瞬时表达结果表明:四个缺失片段中有三个具有启动功能,这三个片段分别为p1700,p1200和p700,其中p1700的启动活性最强。实验结果表明:利用染色体步移技术已经获得了BvM14-MADSbox基因的启动子序列。