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研究目的 对于女性而言,卵巢癌是常见妇科恶性肿瘤之一。因卵巢癌具有早期症状隐匿、进展迅速、复发率高且缺乏针对性治疗等特点,导致致死率居于妇科恶性肿瘤之首。肿瘤微环境是肿瘤发生、发展的必备条件。作为微环境的重要组分,间充质干细胞、外泌体及相关miRNA参与肿瘤发生、发展过程。本研究旨在明确人类间充质干细胞（MSC）来源的外泌体miR-214-5p对卵巢癌生物学行为的影响及可能发挥作用的信号通路,以期为卵巢癌可能存在的治疗靶点提供新思路。研究方法 1.细胞培养 配置含有10%去除牛源性外泌体后的胎牛血清及1%青霉素-链霉素双抗的DMEM培养基作为细胞完全培养基对本研究所需A2780、SKOV3人类卵巢癌细胞进行培养。无外泌体血清配置的完全培养基培养MSC细胞。三类细胞分别编号分组,在培养至一定细胞密度后进行后续实验。2.miRNA的筛选及验证 利用前期对人类卵巢癌细胞分泌的外泌体miRNA高通量测序获得的差异表达谱,选取包含 miR-486-5p、miR-214-5p、miR-200b-3p 及 miR-203a 在内的 4 条 miRNA。验证4条miRNA在卵巢癌细胞（A2780、SKOV3）中的表达,利用CCK8及Transwell迁移实验明确4条miRNA间相应生物学行为差异,选取后续实验目的基因。3.外泌体的提取及鉴定 体外培养人类间充质干细胞,超速离心法提取所需沉淀物样品。利用透射电子显微镜观察样品形态,纳米粒径检测仪测定样品径粒大小,蛋白印迹法（Western Blot）分析样品相关标签蛋白表达。观察所测形态、大小是否符合外泌体特点。4.荧光显微镜观察MSC来源外泌体miR-214-5p进入卵巢癌细胞 体外培养转染cy3标记miR-214-5p的人类间充质干细胞,提取外泌体后用PKH67进行荧光标记。将提取后的外泌体与人类卵巢癌细胞（SKOV3）进行共孵育。RT-PCR鉴定孵育前后miRNA表达水平。5.MSC来源外泌体与卵巢癌细胞共培养 体外培养转染miRNANC、miR-214-5p的MSC,提取外泌体。在两组无干预的人卵巢癌细胞（A2780）中分别加入 MSC-exo-miRNANC、MSC-exo-miR-214-5p mimics,共培养至一定细胞密度后进行后续实验。同法处理SKOV3组细胞。6.外泌体miRNA-214-5p对卵巢癌细胞的作用 CCK8实验检测细胞生长增殖、FACS细胞凋亡实验检测细胞凋亡、Transwell迁移实验及划痕实验等检测细胞迁移、转移能力,验证间充质干细胞来源外泌体miR-214-5p对卵巢癌细胞的作用。7.miRNA-214-5p生物学信息分析 利用DisGeNET及HuGENavigator中的Phenopedia数据库对人类卵巢癌相关基因进行检索。Python明确两个数据库中交集部分,Jvenn绘制韦恩图。MiRwalk对miR-214-5p可能存在的靶基因进行预测。取上述两部分筛选基因合集部分。DAVID数据库进行相关生物信息学分析,R-Studio绘制气泡图。研究结果1.miRNA的筛选及验证 根据CCK8和Transwell迁移实验结果考虑,转染miR-214-5p的卵巢癌细胞增殖及迁移能力均较对照组明显下降（P＜0.05）,故选择miR-214-5p为后续目的基因。2.外泌体的提取及鉴定 人类间充质干细胞体外培养后超速离心法获得所需沉淀物。透射电镜下沉淀物呈茶托样,纳米粒径检测仪检测径粒大小约141.0nm,蛋白印迹法检测显示标签蛋白CD9、CD81、TSG101阳性,符合外泌体特征,证明自人类间充质干细胞内提取外泌体。3.外泌体miRNA与细胞共孵育 Cy3标记的miRNA可通过电穿孔方式进入MSC内,所提取外泌体PKH67染色后与卵巢癌细胞共培养。荧光显微镜观察发现外泌体可以进入卵巢癌细胞内。RT-PCR鉴定外泌体内及卵巢癌细胞内miRNA表达均升高（P＜0.05）。4.外泌体miRNA-214-5p对卵巢癌细胞的作用 CCK8实验、FACS细胞凋亡实验、Transwell迁移实验等结果发现,转染miR-214-5p mimics的人类卵巢癌细胞增殖、迁移能力较对照组减低（P＜0.05）,凋亡率明显增高（P＜0.05）。5.miRNA-214-5p生物学信息分析 Python明确DisGeNET及HuGE Navigator数据库交集部分基因为382条。MiRwalk对miR-214-5p可能存在的靶基因进行预测。Python再次筛选重复部分,确定包含MAPK1等在内的53条基因。DAVID数据库对上述53条基因进行相关生物信息学分析。GO分析发现miR-214-5p参与正向调节MAPK级联反应、调节血管平滑肌细胞的增殖等过程;KEGG分析发现其可参与MAPK、P13K-Akt、铂耐药等信号通路,介导细胞的增殖、凋亡、耐药及炎症反应过程。R-Studio绘制气泡图。结论1.MSC-exo-miR-214-5p介导了卵巢癌细胞与人类间充质干细胞之间的细胞通讯。2.MSC-exo-miR-214-5p抑制卵巢癌细胞的增殖及迁移,并促进卵巢癌细胞的凋亡。3.生物信息学分析显示miR-214-5p与卵巢癌相关靶基因共53条,具有血管再生、细胞因子活性等生物学行为,MAPK、RAP1等信号通路可能是其发挥作用的分子机制。