论文部分内容阅读
肿瘤的转移潜力与heparanase的表达具有显著的相关性,这是以heparanase为靶点进行抗肿瘤转移药物研究的医学基础.已发现在前列腺癌、肝癌、结肠癌及胰腺癌等肿瘤中均有heparanase高表达,而对中国特有的鼻咽癌的研究尚未见报道.考查鼻咽癌中该酶的表达,可为heparanase抑制剂筛选模型的建立提供新的医学依据,并为建立鼻咽癌新的预后指标和治疗策略提供新思路.针对上述问题,我们进行了以下的研究工作:(1)构建了包含人heparanase全长编码序列的真核表达载体,成功地在CHO-K1细胞中表达出活性重组蛋白并建立了heparanase稳定表达细胞株.损伤愈合实验表明该稳定表达细胞株获得了明显的迁移能力,有望用于以迁移能力为观察指标的heparanase抑制剂细胞水平的筛选;同时,我们还在国内首次建立了heparanase的荧光HPLC活性测定方法,在此基础上进行了heparanase抑制剂分子水平筛选模型的研究.采用临床使用的抗肿瘤药物进行方法学的确证,初步研究表明,吡柔比星(6.02×10<-5>mol/L)和香菇多糖(40.0μg/ml)具有显著的抑制作用.(2)采用PCR及Gene SOE的方法从人heparanase cDNA中扩增得到编码信号肽和8KD肽段的基因序列hpa109(Met<1>-Glu<109>),编码50 KD肽段的基因序列hpa50(Lys<158>-Ile<543>)及融合表达信号肽和50KD肽段的基因序列hpasp50(Δpro,Met<1>-Ala<35>+Lys<158>-Ile<543>),插入到pcDNA3.1/myc-His C表达载体中.pcDNA-hpa50和pcDNA-hpasp50分别单独或与pcDNA-hpa109共转染无heparanase表达的NIH 3T3细胞.(3)用RT-PCR的方法检测鼻咽癌细胞及组织中heparanase的表达,用荧光HPLC的方法检测鼻咽癌细胞中heparanase的活性.结果显示鼻咽癌细胞CNEl,CNE2和HONE1均有heparanase基因的表达并有较强的酶活性.