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目的观察氯化钻(CoCl2)在体外模拟低氧对肝癌Walker256细胞形态的改变及增殖能力的影响,进一步确立合适的肝癌Walker256细胞的体外缺氧模型。并在该缺氧模型基础上观察不同程度缺氧对肝癌Walker256细胞中HSP90蛋白的表达能力的影响,并探讨可能的影响机制。方法1.倒置显微镜法观察不同浓度的CoCl2 (0、50、100、200、300、500nmol/L)和不同浓度的17-AAG (0、0.1、0.25、0.5、1.2μmol/L)分别处理肝癌Walker256细胞48h后,观察其细胞形态的改变。2.MTT法测定不同浓度COCl2 (0、50、100、200、300、500timol/L)和不同浓度的17-AAG抑制剂(0、0.1、0.25、0.5、1.2μmol/L)分别经不同的时间段处理肝癌Walker256细胞,来检测其增殖能力的影响。3.蛋白免疫印迹(Western Blot)法分别检测不同浓度的CoCl2 (0、50、100、200、300、 500μmol/L)和0.5μmol/L 17-AAG作用于Walker256细胞后,对细胞中HSP90及Bcl-2表达的影响。4.Annexin- FITC/PI流式细胞双染技术检测17-AAG对肝癌Walker256细胞的凋亡的影响。5.用Walker256细胞的细胞悬液建立大鼠种植瘤模型,并将成瘤实验大鼠分为经腹腔给予17-AAG和不给予17-AAG两组(各组15只大鼠),观测比较两组大鼠种植瘤的平均体积。结果1.不同浓度的CoCl2对细胞具有一定程度的增殖抑制作用。300μmol/L和500μmol/L CoCl2作用于细胞,镜下观察可见大量细胞碎片,细胞膜出现明显的皱缩。Western Blot结果显示CoCl2处理细胞48h后,能够上调HSP90的表达,该作用具有浓度依赖性。2.不同浓度的HSP90抑制剂17-AAG对Walker256细胞的增殖抑制作用具有时间和剂量的依赖性。17-AAG对细胞形态也有影响,对照组Walker256细胞饱满呈圆形,胞质丰富,大小均一,包膜完整,而经17-AAG作用48 h后的Walker256细胞则明显减少,细胞边缘模糊、形态差,部分细胞包膜破裂。Annexin-FITC/PI染色法检测分析结果显示：①与常氧组相比低氧组细胞凋亡比率无明显差异(P>0.05)；②与常氧组相比较17-AAG+常氧组细胞凋亡比率增加(P<0.05)；③与低氧组相比17-AAG+低氧组细胞凋亡比率增加(P<0.05)；④与17-AAG+低氧组相比17-AAG+常氧组细胞凋亡比率增加((P<0.05)。同时通过Wester Blot检测分析结果显示：①与常氧组相比,低氧组的HSP90和Bcl-2表达增强(P<0.05)；②与常氧组相比,17-AAG+常氧组的HSP90和Bcl-2表达受到抑制(P<0.05)；③与低氧组相比,17-AAG+低氧组的HSP90和Bcl-2表达也受到抑制(P<0.05)；④17-AAG+低氧组与17-AAG+常氧组相比,HSP90和Bcl-2的表达差异均无统计学意义(P>0.05)。3.17-AAG抑制剂能够明显抑制大鼠种植瘤的生长,随着给药时间的延长,发现给药组大鼠种植瘤生长较对照组明显缓慢,对照组大鼠种瘤平均体积始终呈增长的趋势。结论1.不同浓度的CoCl2能诱导HSP90的表达,当CoCI2在200μmol/L的剂量时诱导作用最为明显。2.HSP90抑制剂17-AAG能够明显抑制大鼠种植瘤的生长。3.HSP90抑制剂17-AAG能够明显的促进细胞凋亡的发生,因而推测其机制可能是17-AAG与HSP90结合后,抑制抗凋亡蛋白Bcl-2表达,从而使肿瘤凋亡明显增加。