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目的 T1DM是一种自身免疫性疾病，现在的治疗手段主要是注射外源胰岛素或胰腺（胰岛）移植来维持正常的血糖水平。但是这两种方法均存在不可避免的缺点。随着分子生物学技术的发展，转基因技术在克服了技术问题，道德伦理问题和调控机制的人工操作问题后，将成为T1DM治疗的最佳选择。T1DM的转基因治疗目前仍处于试验阶段，其基本过程分以下六个步骤：（1）人胰岛素原基因的获取；（2）连接调控元件并与载体连接；（3）重组质粒导入包装细胞；（4）筛选出含重组DNA分子的受体细胞克隆；（5）克隆基因的表达及表达产物的检测与分离纯化；（6）动物实验。本实验在重组质粒已经构建成功的基础上，主要进行第（3）、（4）步操作，即将含人胰岛素原基因（其上游连接有两个调控元件：LPK基因启动子中的GIBE和IC-FBP-1基因启动子）的逆转录病毒载体导入PA317包装细胞系，并采用NIH3T3细胞测定病毒滴度，筛选出一株高效特异的产病毒细胞克隆，为下一步的细胞水平和动物水平实验打下基础。从而为同类试验探索出一条成熟的技术路线。 方法 本试验根据前试验所采用的逆转录病毒载体PLXSN的特点，选用PA317包装细胞系并采用脂质体转染法对PLXSN进行包装，利用NIH3T3细胞筛选出一株高滴度产病毒细胞克隆，扩大培养并取其病毒上清，最后应用酚-氯仿-异戊醇抽提DNA方法分别提取PA317和PLXSN的细胞基因组DNA，进行PCR反应对目的基因进行扩增，反应产物经琼脂糖凝胶电泳，检查有无目的基因片段。结果 1.提取转染用质粒后经琼脂糖凝胶电泳未发现明显RNA带，紫外分光光度计检测示其浓度为50扩血。 2.经脂质体介导将PLxSN导人PA317细胞并用以18筛选的第4天，细胞开始出现死亡，第7天死亡明显，第13天形成大小不等的克隆，而对照组无克隆形成且绝大部分死亡。 3.用所提取的PA317/PLxsN病毒上清感染Nlll3竹细胞，3天后可见NIH3竹细胞开始出现死亡，10天后抗性阳性克隆开始形成。 4.扩大培养的阳性克隆细胞基因组DNA扩增出一条特异的的人胰岛素原基因片段97Obp电泳条带，而未转染细胞基因组则无此条带，证明外源基因已在细胞基因组上稳定整合。结论 含调控基因的人胰岛素原重组质粒构建成功后，如欲进行下一步实验，必须大量制备该基因重组体，以保证充足的来源。本实验针对逆转录病毒载体的特点，选用PA317包装细胞系采用脂质体转染法将PLxS“成功导人，并利用MH3竹细胞筛选出一株高滴度产毒细胞克隆以317/P以sN，并通过提取细胞DNA，PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳证明已稳定整合于PA317细胞基因组上，其结构正确。成功构建的细胞株可以源源不断产生大量的含基因重组体的复制缺陷型病毒，从而为下一步细胞水平及动物水平研究铺平了道路。