败血症(sepsis)是一种严重的细菌性感染疾病,在新生儿中具有较高的死亡率,发病隐匿,临床症状无特异性。因此,寻找一种快速、准确的败血症早期诊断方法,对指导临床治疗、降低患儿死亡率、改善预后,具有十分重要的意义。目前,细菌培养是作为“金标准”在诊断临床细菌性病原微生物标本,然而该方法缺乏快速和敏感性。在本研究中,我们分析细菌16s rRNA基因序列,在其保守区设计通用引物和革兰阴、阳性菌分型探针,建立了细菌革兰双检荧光定量PCR新方法,并对临床的相关标本进行了检测。本研究分二部分:第一部分,细菌革兰双检荧光定量PCR技术的建立;第二部分,细菌革兰双检荧光定量PCR技术临床应用。第一部分细菌革兰双检荧光定量PCR技术的建立方法:分析临床常见菌16S rRNA基因序列,在高度保守区自行设计通用引物和革兰阳性和阴性分型探针,建立细菌革兰阴、阳性菌双通道荧光定量PCR检测体系,选取临床较常见的53株临床分离株(25株为革兰阳性菌、28株为革兰阴性菌)进行细菌革兰双检荧光定量PCR方法检测,以评价该方法探针的特异性;以金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌分别代表革兰阳性和阴性菌进行浓度梯度稀释,稀释品进行该方法的检测以评价细菌革兰双检荧光定量PCR的敏感度和线性关系。结果:细菌革兰双检荧光定量PCR具有较好的敏感性和特异性,最低能检测到3个金黄色葡萄球菌,而大肠杆菌可以检测低到1个细菌数。53株临床培养分离株进行该方法检测:25株革兰阳性菌株通过革兰阳性探针(FAM-G~+探针)检测均为阳性,28株革兰阴性菌株通过革兰阴性探针(VIC-G~-探针)检测均为阳性,反之均为阴性,符合率100%。巨细胞病毒、EB病毒、乙肝病毒,新型隐球菌及白色念珠菌,人基因组DNA及空白对照均为阴性。结论:建立了用通用弓J物和分型双荧光探针的细菌革兰双检荧光定量PCR方法。其检测快速、准确,具有较大的临床推广应用和临床指导用药价值。第二部分细菌革兰双检荧光定量PCR技术临床应用方法:用建立的细菌革兰双检荧光定量PCR方法对1000例临床疑似为败血症的患儿血标本和125份拟诊为化脓性脑膜炎的脑脊液标本,进行该方法的检测,同时进行细菌培养对照实验,检测结果进行统计学分析。结果:1.在1000例血标本中,细菌革兰双检荧光定量PCR共检出64例阳性标本,其中革兰阳性菌40例,革兰阴性菌24例,阳性率为6.40%(64/1000);血培养共检出50例阳性,阳性率为5.00%(50/1000),阳性率前者高于后者,差异有统计学意义(P＜0.01)。2.在125份脑脊液标本中,细菌革兰双检荧光定量PCR共检出17份阳性,其中革兰阳性菌为10份,革兰阴性菌为7份,阳性率为13.6%(17/125);脑脊液细菌培养共检出6份阳性,阳性率为4.8%(6/125);阳性率前者显著高于后者,差异有统计学意义(P＜0.01)。3.以细菌培养为对照,对血标本和脑脊液标本进行汇总,细菌革兰双检荧光定量PCR的检测敏感度为91.07%,特异性为97.36%,约登指数为0.8843,检测符合率为97.05%,kappa值0.89。结论:建立的细菌革兰双检荧光定量PCR技术新方法用于临床标本(包括血、脑脊液)的检测,具有快速、特异、敏感的特点,可为临床早期、准确诊断败血症和化脑等细菌性感染疾病提供新方法。