在全球范围内，宫颈癌是妇女因恶性肿瘤而死亡的第二位死因。世界范围内宫颈癌每年的新增病例50万，死亡病例23万，其中三分之二的病例是在发展中国家。现在已经明确持续性高危型HPV的感染是宫颈癌发生的重要原因，其中HPV16感染是宫颈癌最主要致病因子，由HPV16感染发展引起的宫颈癌占宫颈癌总数的54％，而我国HPV16阳性的宫颈癌占宫颈癌总数的79.6％。2006年MERCK公司生产由病毒主要外壳蛋白组成病毒样颗粒疫苗已经问世，该疫苗免疫后可有效诱发机体产生高滴度的针对病毒颗粒表面L1表位的中和抗体，因此可预防HPV16、18、6及11型病毒感染及感染相关疾病。由于病毒的外壳蛋白在宫颈癌细胞中表达量极低或不表达，因此目前尚未发现该疫苗对HPV感染及感染相关疾病的治疗具有肯定作用。我国是宫颈癌的高发区，因此研制研发针对HPV16的免疫效果好而成本低的治疗性疫苗意义重大。由于DNA疫苗具有安全性好、成本低、易于大量制备并可以反复应用等优势，因此是适合我国国情的宫颈癌治疗性疫苗的理想选择。HPV16 E7是病毒的主要转化基因，E7蛋白的持续高水平表达是肿瘤细胞恶性表型维持所必需的。E7蛋白是异源的病毒蛋白，属于肿瘤特异性抗原，因此是宫颈癌免疫治疗的理想靶抗原。为了消除E7蛋白的转化活性并增强其免疫原性，本课题组对HPV16疫苗进行了长期的探索研究，在前期工作中，我们通过联合多种策略，包括基因切割重排、密码子优化、转化活性位点的点突变等优化改造了HPV16 E7基因。全基因合成法获得了优化改造后的E7基因，命名为mE7，并构建了VR1012-mE7重组质粒，Western blot证明该优化基因在体外可正确表达。鉴于DNA疫苗的体内转染效率低，免疫原性相对较差，因此mE7 DNA疫苗的免疫原性需要进一步增强。研究发现CD40配体（CD40 ligand，CD40L）与APC细胞特别是DC细胞表面的CD40相互作用，可促进APC细胞的活化，增强APC细胞对抗原的加工呈递，同时促进DC细胞分泌IL-12、TNF-α、IL-8等细胞因子，并能促进Th1类细胞活化。因此本研究将mE7与CD40L胞外区融合获得mE7／CD40L融合基因，构建该融合基因的真核表达质粒pVR1012-HPV16 mE7／CD40L用于DNA疫苗研究。脂质体法瞬时转染NIH 3T3细胞，Western blot法对此重组基因的表达水平进行分析。表达确定后，碱裂解-PGE法大量提取纯化上述质粒，肌肉免疫C57BL／6小鼠进行E7特异性的细胞免疫、体液免疫及体内抗瘤活性的检测，结果具体如下：1．mE7／CD40L融合蛋白的体外表达质粒pVR1012-mE7／CD40L瞬时转染NIH 3T3细胞，通过Western blot方法鉴定了mE7／CD40L在细胞中的表达水平，实验结果显示mE7／CD40L相对分子量大小约为51 kDa，与理论分子量基本一致。2．ELISPOT检测不同DNA疫苗组小鼠脾细胞中分泌IFN-γ的E7特异性CD8⁺ T细胞的数目分别于6-8周龄雌性C57BL／6小鼠双侧股四头肌内注射pVR1012-mE7和pVR1012-mE7／CD40L重组质粒，同时设野生型E7基因（wE7）表达质粒pVR1012-wE7、CD40L表达质粒pVR1012-CD40L及空载组作为对照组。免疫剂量100ug／鼠，免疫2次，间隔一周，最后一次免疫7天时，取小鼠脾细胞，体外经E7_49-57 CTL表位肽刺激后，用ELISPOT检测分析免疫小鼠脾细胞E7特异性CD8⁺ T细胞的活化情况。结果显示，mE7免疫组小鼠脾细胞中E7特异性分泌IFN-γ的CD8⁺ T细胞数目明显高于wE7免疫组，mE7／CD40L基因免疫组所诱发产生的E7特异的分泌IFN-γ的CD8⁺ T细胞显著高于mE7免疫组。表明本课题组优化改造的mE7基因免疫，与野生型E7基因免疫相比，可显著提高E7特异的CD8⁺ T细胞的活化水平，融合CD40L后构建的mE7／CD40L融合DNA疫苗可进一步增强E7特异的CD8⁺ T细胞的活化水平。3．FACS分析各DNA疫苗组中E7特异性CD4⁺ T细胞介导的免疫反应小鼠免疫如上所述，于最后一次免疫后第7天时，对免疫后的小鼠的脾细胞用E7长肽（30-67氨基酸）体外过夜刺激，然后用流式细胞仪来分析经CD4及IFN-γ双染后的T细胞。实验结果显示，各个实验组之间的双染T细胞（CD4⁺ IFN-γ⁺）数目并没有统计学差异。4．ELISA检测血清中E7特异性抗体的水平小鼠免疫如上所述，于最后一次免疫后一周时，用ELISA的方法检测免疫后小鼠E7特异性抗体的水平。结果显示，mE7及mE7／CD40L免疫组的抗体水平要明显高wE7免疫组，但是mE7及mE7／CD40L免疫组之间的抗体水平无显著性差异，表明本课题组优化改造的mE7基因免疫，与野生型E7基因免疫相比，可显著提高E7特异的抗体水平。5．疫苗体内抗瘤活性的检测分别于6-8周龄雌性C57BL／6小鼠（每组8-10只）双侧股四头肌内预防性免疫pVR1012-mE7和pVR1012-mE7／CD40L重组质粒，同时设pVR1012-wE7、pVR1012-CD40L及空载组作为对照组。免疫2次，间隔一周。最后一次免疫的第7天时，用7.5×10⁴个TC-1细胞皮下接种攻击，随后每周观察记录肿瘤生长情况2-3次。结果显示，而mE7及mE7／mCD40L实验组小鼠于实验结束时（即瘤细胞接种后45天时），100％的小鼠未见移植瘤的形成，而对照组小鼠在瘤细胞接种后10天左右全部形成移植瘤。同时，取6-8周龄的雌性C57BL／6小鼠，先皮下接种7.5×10⁴个TC-1肿瘤细胞，模拟机体的荷瘤状态，三天后在小鼠双侧股四头肌内分别注射100ug的mE7、mE7／CD40L、CD40L重组质粒及VR1012空载，免疫2次，间隔一周，随后每周观察并记录肿瘤生长情况2-3次。实验结果显示对照组小鼠于瘤细胞接种后的第8天左右时小鼠全部形成移植瘤，并成渐进性生长，而mE7免疫组，有30％小鼠没有形成移植瘤，mE7／CD40L免疫组小鼠的无瘤率进一步增高达40％。另外mE7／CD40L DNA免疫治疗组小鼠移植瘤消退前取材行组织学观察分析发现，瘤组织中可见大量淋巴细胞浸润，而在对照组的小鼠移植瘤中未发现有此现象。总之，本研究结果表明通过基因切割后重排、密码子优化及基因突变改造后的mE7基因免疫与wE7基因相比，可显著提高E7特异的CD8⁺ T细胞的活化水平，抗体活化水平及体内对移植瘤的免疫预防和免疫治疗作用。为了加强DNA疫苗的免疫原性，本研究构建了HPV16 mE7／CD40L DNA疫苗。研究发现mE7／CD40L基因在小鼠体内所诱发产生的E7特异分泌IFN-γ的CD8⁺ T细胞数目显著高于mE7基因。mE7及mE7／CD40L DNA疫苗均具有显著的免疫预防效果，然而mE7／CD40L DNA疫苗与mE7 DNA疫苗相比在动物免疫治疗实验中显示出较好的抗瘤效果。由于对瘤细胞的免疫治疗作用的好坏主要取决于细胞免疫的活化水平，ADCC介导的细胞毒作用尽管体外可有效地杀伤瘤细胞，但体内尚未见有此活性，因此推测mE7及mE7／CD40L DNA疫苗的免疫治疗作用主要是由活化E7特异的CD8⁺ T细胞所诱发的，表明该mE7／CD40L DNA疫苗对HPV16感染及感染相关肿瘤特别是宫颈癌具有免疫治疗作用，为进一步研发适合我国国情的针对HPV16 DNA治疗性疫苗打下了基础。