研究背景阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD),是一种以进行性认知障碍和记忆能力损害为特征的中枢神经系统退行性疾病,临床表现为认知和记忆功能不断恶化,日常生活能力进行性减退,并有各种神经精神症状和行为障碍。据估计到2025年我国60岁以上老年人将达2.8亿,占全国总人口的18.4%,届时将有1009万的AD患者。随着我国社会老龄化的日趋明显和人均寿命的不断提高,AD对人类生命健康的威胁日益突出。AD的特征性病理学特征包括,淀粉样斑块、神经原纤维缠结(neurofibrillary tangles, NFTs)、神经元丢失、血管淀粉样变性、炎症性浸润以及氧化损伤等。有关AD发病机制的学说众多,如蛋白异常学说、基因突变学说、突触功能紊乱学说、线粒体功能紊乱学说、神经炎症反应学说、钙平衡失调学说等。Aβ产生与清除失衡,进而神经细胞内Aβ蓄积和沉积形成淀粉样斑块,以及Aβ的神经毒性是散发性AD最原始的病理因素之一。这也被称之为淀粉样蛋白级联假说(amyloid cascade hypothesis),越来越远被广大学者所接受。可溶性Aβ的寡聚体和中间状态的淀粉样斑是Aβ具有神经毒性的主要形态。Aβ40倾向形成神经纤维,而Aβ42更易形成淀粉样斑块。淀粉样斑块易附着在AD脑组织的微血管壁上,引发脑血管淀粉样病变,致使脑血管功能紊乱。另外Aβ的蓄积出现在tau蛋白蓄积之前,并促进tau蛋白过度磷酸化,诱发或加速形成NFTs,扰乱轴突的转运功能。Aβ可引起强烈的局灶性炎症反应,活化的小胶质细胞和反应性星形胶质细胞聚集在淀粉样斑块和NFTs,并分泌大量的趋化因子和炎症因子。Ap对线粒体有很强的毒性,尤其是它对突触小泡的毒性。Ap寡聚体可抑制基础性的突触传递,以及减少树突触的数量,导致突触的可塑性损伤。Aβ还能损伤烟碱型乙酰胆碱受体(nicotinic acetylcholine receptor,nAChR)的信号传导,以及ACh从突触前的末端释放。在AD患者脑内的研究发现,淀粉样斑块周围聚集大量活化的星形胶质细胞。这提示星形胶质细胞在清除Aβ的过程中,起着非常重要的作用。体外研究发现,星形胶质细胞可以促进神经元的生长存活,而含有吞噬Ap的星形胶质细胞与神经元混合培养,则加速神经元的死亡。星形胶质细胞内化吞噬Aβ后,导致细胞内钙平衡紊乱、能量代谢障碍、增加氧化应激反应,进而导致星形胶质细胞和神经元死亡。星形胶质细胞在神经内源性免疫中起着非常重要的作用,与各类神经退行性疾病有着密切联系。星形胶质细胞可以合成分泌各种神经营养因子,促进神经元的生长,保护神经元的存活,维持脑内内环境稳态。星形胶质细胞可以合成分泌APOE,促进脑内Ap的清除。视黄酸(retinal acid,RA)是机体正常发育不可缺少的重要因子。RA通过激活其核受体,调节基因的转录。RA信号通路参与调节胚胎发育,细胞增殖、分化、凋亡,维持正常的免疫功能,以及神经元的形成、存活。在脑内,RA受体主要分布于皮层和海马等区域。大量研究表明,RA对于AD等神经退行性疾病均有保护作用,其机制可能与RA具有抗氧化应激损伤、抗炎作用、促进α-分泌酶裂解APP、诱导APOE表达等相关。在脑内,RA受体主要分布于皮层和海马等区域。大量研究表明,RA对于AD等神经退行性疾病均有保护作用,其机制可能与RA具有抗氧化应激损伤、抗炎作用、促进α-分泌酶裂解APP、诱导APOE表达等相关。RA在体内存在多种形式,但是在人体内发挥重要作用的主要活性成分是ATRA。本课题拟研究RA的主要活性成分全反式维甲酸(ATRA)对Ap引起的星形胶质细胞凋亡是否具有抑制作用,进而探讨其相关的作用机制。研究内容1.星形胶质细胞的原代培养与鉴定取出生1-2天的C57BL/6J乳鼠,分离大脑皮层。采用组织块消化法进行原代培养,再利用差速贴壁技术分离纯化星形胶质细胞。采用GFAP、DAPI免疫组化共染细胞的方法鉴定星形胶质细胞。2. ATRA对星形胶质细胞凋亡的影响在原代培养的星形胶质细胞培养基中加入2μg/ml的Aβ42,诱导其细胞凋亡。采用hoechst33258染色法,观察星形胶质细胞的凋亡形态变化。再加入0.01μM、0.1μM、1μM、10μM的ATRA孵育24小时,利用MTT法检测各组星形胶质细胞的存活率。3. ATRA对星形胶质细胞APOE、BACE1mRNA表达的影响在原代培养的星形胶质细胞培养基中加入2μg/ml的Aβ42,诱导其细胞凋亡。分别加入0.01μM、0.1μM1μm、10μM的ATRA孵育24小时,利用TRIzol法提取ATRA处理后的各组星形胶质细胞的总RNA,采用罗氏逆转录试剂盒和qPCR试剂盒,检测各组星形胶质细胞APOE、BACE1mRNA的表达情况。4. ATRA对星形胶质细胞APOE、BACE1的影响在原代培养的星形胶质细胞培养基中加入2μg/ml的Aβ42,诱导其细胞凋亡。分别加入0.01μM、0.1μM、1μM、10μM的ATRA孵育24小时,提取各组细胞总蛋白,BCA法测各组细胞总蛋白浓度,再采用Western Blot法检测各组星形胶质细胞中APOE、BACE1的蛋白表达情况。5. ATRA对星形胶质细胞Ap清除的影响在原代培养的星形胶质细胞培养基中加入2μg/ml的Aβ42,诱导其细胞凋亡。再加入1μM的ATRA孵育24小时。分别收集各组培养液和星形胶质细胞,通过ELISA试剂盒检测细胞培养液和星形胶质细胞中Ap含量。实验结果1.星形胶质细胞的原代培养与鉴定本实验采用GFAP、DAPI共染细胞的方法鉴定星形胶质细胞,星形胶质细胞纯度>95%。2. ATRA对星形胶质细胞凋亡的影响通过hoechst33258染色观察星形胶质细胞形态变化,研究发现Aβ42诱导加速细胞凋亡。不同浓度的ATRA对Aβ42诱导的星形胶质细胞凋亡作用不同,其中0.1μM,1μM可以抑制Aβ42诱导的星形胶质细胞凋亡,差异有统计学意义(P<0.05)。3. ATRA对星形胶质细胞APOE、BACE1mRNA表达的影响与对照组比较,0.1μM、1μM ATRA能显著上调星形胶质细胞中APOE mRNA的表达,差异有统计学意义(P<0.01),而对BACE1mRNA的表达无明显变化。4. ATRA对星形胶质细胞APOE、BACE1表达的影响与正常对照组相比,Aβ42的处理能显著上调星形胶质细胞中APOE的蛋白表达；加入ATRA后,APOE的蛋白表达继续上调,差异有统计学意义(P<0.01),然而ATRA对BACE1的蛋白表达无影响。5. ATRA对星形胶质细胞Aβ清除的影响实验组与对照组相比,ATRA能显著减少星形胶质细胞(P<0.01)及培养液(P<0.05)中Ap含量。实验结论ATRA可以诱导星形胶质细胞APOE表达上调,增加星形胶质细胞Ap清除率,抑制Aβ42诱导的星形胶质细胞凋亡。低浓度ATRA对星形胶质细胞有保护性作用。ATRA对星形胶质细胞BACE1表达无明显影响。高浓度的RA具有一定的细胞毒性。