非酒精性脂肪肝(NAFLD)是最常见的一种肝脏慢性疾病，会导致一系列的肝损伤，包括脂肪变性、脂肪性肝炎、脂肪纤维化和肝硬化等症状。然而，NAFLD发病的分子机制仍不清楚。蛋白质组学(proteomics)是对细胞或机体中蛋白质的功能、结构进行分析的组学研究，其将为深入研究NAFLD提供理论和实验依据。本文研究的目的是希望通过蛋白组学技术在高脂诱导的细胞模型中识别差异表达蛋白，进而研究其分子作用机制。这些结果将为未来NAFLD的预防和治疗提供潜在的研究靶点。具体的工作内容如下:　　(1) NAFLD体外模型的建立及相关调控蛋白的筛选鉴定:针对NAFLD发病过程中脂质富集特征，构建体外NAFLD细胞模型。选取外源脂肪酸OA处理SMMC-7721细胞系，对细胞增殖、脂质积累情况进行测定，筛选诱导剂合适的作用时间和作用浓度，发现在1mMOA处理24h时作用效果最好。然后通过双向电泳技术和质谱分析方法作用于对照组和OA处理组，获得二维图谱，蛋白点质谱分析，通过q-PCR和western blot技术进行验证。发现在650个差异蛋白点中筛选出15个2倍表达差异的蛋白点，7个蛋白表达上调(CALR、LaminB1、Glycine-tRNA ligase、EEF1G、TPI1、PGK1、EIF3I)，8个蛋白表达下调(CALU、TPM4、KCIP-1、Annexin A5、HSP90、HSP70、plastin-3、Actin-2)，其中转录调控占53.4％，参与代谢过程13.3％，细胞骨架20％，细胞信号转导13.3％。表明NAFLD的发病过程涉及到不同功能性表达的蛋白。根据蛋白表达倍数差异，选择变化最显著的CALR蛋白作为下一步实验对象。　　(2) CALR脂代谢功能研究:应用免疫荧光细胞化学技术对CALR的细胞定位进行显微镜检测，发现在细胞质、细胞核均有表达;应用Fluo-3-Am荧光染色和流式细胞术技术，发现钙离子在其中并没有差异性改变。应用siRNA干扰技术，对SMMC-7721细胞中的CALR基因敲减，发现在24h和48h表达水平均有明显下调，CD36和PPAR-αmRNA和蛋白水平表达增加。构建pcDNATM3.1(+)-CALR质粒，通过瞬时Lipofectamine2000转染293T细胞使CALR基因过表达，发现在24h和48h CALR蛋白和基因均有明显上调，CD36和PPAR-α mRNA和蛋白水平表达下调。在外源OA诱导下，油红O染色发现CALR促进脂质积累。以上结果表明CALR通过影响CD36和PPAR-α从而促进脂肪积累，在这个过程中不涉及钙离子变化。　　(3)吉非罗齐的细胞降脂机制研究:吉非罗齐，作为PPARα激活剂，是临床中降血脂的药物，但有关它的细胞降脂机制尚不清楚。利用已构建的NAFLD细胞模型，通过油红O染色、TLC实验，首先研究了吉非罗齐的细胞降脂作用，结果发现50μM吉非罗齐对细胞没有杀伤，但是可以降低细胞中总脂、甘油三酯水平。然后检测了吉非罗齐对细胞中脂代谢通路中关键基因CD36、SREBP1、PPARα mRNA和相应蛋白质水平的改变，发现吉非罗齐可以上调PPARα和SREBP1蛋白表达，而对CD36没有显著影响。对PPARα和SREBP1下游相关的LIPIN1、DGAT2、CPT2等基因进行验证，发现吉非罗齐通过促进脂代谢氧化途径和合成途径参与脂代谢。