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草菇(Volvariella volvacea)原产于我国热带和亚热带,是典型的高温型草腐真菌,对温度变化很敏感,尤其是对低温的抵抗力差,在4℃的低温条件下保存,菌丝会发生自溶而导致菌种死亡和子实体发软、液化直至腐烂。这就限制了草菇的生产流通和产后保鲜,此外,草菇的生物学效率也很低。本文通过草菇与杏鲍菇的原生质体融合,以单亲灭活杏鲍菇原生质体为标记,以O℃低温为筛选指标,选育出耐低温草菇菌株F-1(华农大草菇8号)。同时,以草菇菌丝和菌褶为诱变材料,进行紫外诱变、氯化锂诱变、微波诱变以及复合诱变,用0℃低温筛选出高产、耐低温的草菇菌株UV2’(华农大草菇9号)、LU2(华农大草菇6号),并对其进行鉴定。主要研究结果如下:
(1)确定杏鲍菇原生质体制备和再生的最佳条件:菌龄5d的菌丝在0.6mol/L甘露醇配制的1.5%溶壁酶溶液中,32℃酶解3h。
(2)草菇V138菌丝的O℃低温致死时间为36h,其原生质体再生菌丝的0℃低温致死时间则为144h,而杏鲍菇原生质再生菌丝O℃低温致死时间大于草菇。
(3)通过草菇与热灭活的杏鲍菇原生质体融合,以0℃低温反复筛选,选育出耐0℃低温192h的耐低温菌株F-1。
(4)确定了紫外诱变的最佳诱变参数:菌丝在距离15W紫外灯管30cm处照射60min时,致死率为70%,诱变获得的菌株耐O℃低温时间最长,达72h。
(5)确定了氯化锂诱变的最佳诱变浓度为0.6%,此时耐O℃低温的正突变率最高,耐受时间也最长,达84h。
(6)确定了微波诱变的最佳诱变参数为:输出功率800W、脉冲频率为2450MHz的微波炉处理45s,此时的致死率为56.67%,耐低温的正突变率最高,可耐0℃48h。
(7)确定了复合诱变的最佳参数:菌丝在氯化锂浓度0.6%和15W紫外灯照射50min的复合作用下,耐低温时间可达96h。
(8)通过紫外诱变革菇V138菌丝、菌褶,菌丝的氯化锂诱变、微波诱变及复合诱变,以0℃反复筛选,选育出耐0℃低温的菌株M5、L3、L6、UV2’、LU2、UV2。除L3外,各诱变菌株在较低温度(18℃、25℃、30℃)下生长速度显著高于CK。各诱变菌株经过品比实验,结果表明各诱变菌株在26~30℃的生物学效率均大于CK,筛选出UV2’和LU2为耐低温高产菌株,其中LU2生物转化率达到29.11%。
(9)在4℃、16℃、25℃时对草菇子实体进行贮藏试验发现,三种温度条件下,草菇在16℃时贮藏期最长,其次是25℃,4℃时最短。UV2’在16℃的贮藏期最长,可达96h,比CK高出100%。L6可耐84h。
(10) AFLP分子鉴定表明,各诱变菌株及融合株与对照株在凝胶电泳差异显示出清晰、大小为800bp-2000bp的特异条带,说明选育的新菌株与对照株在DNA分子水平上有差异。