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目的:单基因遗传病又称为孟德尔遗传病,目前已报道的单基因遗传病(表型)约有6000多种,已明确致病基因的约有4000多种,但还有2000多种疾病的致病基因未知。全外显子组测序(Whole exome sequencing,WES)是指利用序列捕获技术将全基因组外显子区域DNA捕捉后进行高通量测序的基因组分析方法,是目前鉴定单基因遗传病致病基因最重要的研究方法。本研究旨在基于WES技术发掘和鉴定新致病基因,并进行相关的致病机制研究。方法:1.建立包括外显子文库建立、上机测序、数据分析和变异解释验证在内的完整WES方法,即利用Agilent Sure Select方法外显子捕获,Illumina测序平台进行高通量测序,测序数据经Next GENe?软件匹配分析后,用Ingenuity在线软件系统进行变异筛选确认及解释。2.收集16个不同表型特征的单基因遗传病家系为研究对象,选择家系成员(共计24例患者)的DNA样本做WES检测。评估测序数据的覆盖度、深度和均一性等,生物信息学分析方法分析鉴定候选致病基因,用Sanger测序法在家系成员中验证并鉴定新致病基因。3.构建候选基因的野生型和突变型表达质粒,比较在HEK293T细胞中GDF6蛋白的表达。结果:1.使用Agilent Sureselect V4试剂盒制备WES文库,99%以上的目标区域可以被成功捕获,70%以上的Reads位于靶序列以内。当平均测序深度达到100X时,20X以上覆盖区域>92%,且均一性较为一致。采用Illumina Hiseq2000和Miseq测序平台,Reads与人类基因组参考序列匹配度>99%。每个样本约有18,000多个SNVs位于编码区,其中约60%的变异为同义变异,40%为错义变异,约有60~80个变异为无义突变、200个为Indels。2.测序数据通过Ingenuity Variant Analysis软件分析、Sanger测序验证后,16个单基因遗传病家系中的8个家系鉴定到了致病基因,包括GDF6、GLI3、EXT2、GORAB、COL4A5、IDS、COMP和PTHLH基因。3.在多发性骨性连接综合征(mμltiple synostoses syndrome,SYNS)家系中鉴定到GDF6基因杂合错义突变p.Y444N,该突变与家系成员骨融合表征完全共分离,确认GDF6基因为SYNS新致病基因。4.在转染的293T细胞培养液上清中,GDF6成熟蛋白(mature-GDF6)的含量,突变型(p.Y444N)与野生型相比明显降低。结论:1.本研究建立了WES整个实验室流程,包括文库捕获、文库质量鉴定、上机测序、数据分析、变异解释和结果验证等。该方法捕获效率优良、测序质量可靠、生物信息学软件全面,能够有效检测、鉴定单基因遗传病致病基因。2.利用WES技术在SYNS家系中鉴定到新的致病基因GDF6基因,错义突变p.Y444N可以影响GDF6成熟蛋白的分泌表达,可能是引起SYNS的致病机制之一。