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大黄为我国传统泻下类药物,临床应用已有千年历史。现代药理学机制表明,大黄口服后需经肠道菌群中的多种酶水解转化成活性代谢产物,才能发挥导泻作用。临床研究发现,长期使用大黄蒽醌类泻剂会产生耐药性甚至结肠黑变病(Melanosis Coli,MC)等一系列不良反应,然而导致毒副作用的物质基础,以及对肠道微生态的影响尚不明确。本课题以长期服用大黄总蒽醌大鼠为研究对象,利用HPLC技术,分析药物在体内外肠菌液体中的代谢产物;利用GC法检测用药大鼠肠道菌液中短链脂肪酸(Short Chain Fatty Acids,SCFAs)的含量,同时观察大鼠给药期间一系列生理指标,最终阐明大黄总蒽醌长期给药导致大鼠结肠组织及肠道微生态发生变化的物质基础。(1)制备大黄总蒽醌,建立可以同时检测结合型和游离型蒽醌的HPLC条件,检测其主要化学成分番泻苷A(Sennoside A,SA)的含量,约为大黄总蒽醌的8.99%(g/g)。(2)连续3个月灌服大鼠大黄总蒽醌,为维持大鼠23级腹泻,给药剂量增加了10倍;实验结束,大鼠出现泻下耐药及结肠黑变病,为后期样品采集提供了可靠的动物模型。(3)观察大鼠给药过程中体重、粪便失水率、菌液OD值的变化,造模结束分析大鼠脏器指数及病理组织变化。结果显示大黄总蒽醌给药组大鼠体重、粪便失水率、菌液OD值均低于正常组。与正常组相比,给药组大鼠心、结肠、胃脏器指数显著升高;脾、前列腺脏器指数降低。病理组织观察显示给药组大鼠结肠杯状细胞受损严重、腺体破坏、隐窝结构中大量炎性细胞浸润,且有明显黑色素颗粒沉着。(4)定期收集给药期间大鼠粪便和血清样品,采用HPLC法检测肠菌液及血清中代谢产物含量。结果显示,随着给药周期延长和剂量增加,给药组大鼠肠菌液及血清中大黄酸含量明显增高。(5)定期收集给药期间大鼠粪便菌液,通过体外孵育系统评价各组肠菌液代谢能力。HPLC法分别检测番泻苷A在体外孵育系统中的代谢产物,并对代谢产物M1、M2(芦荟大黄素)、M3(大黄酸)、M4和M5进行含量测定及主成分分析,结果显示给药组大鼠肠菌液对SA的降解速率明显高于正常组,提示大黄长期给药促进了大鼠肠道菌群对药物的代谢作用,是造成代谢产物积累的原因之一。(6)定期收集给药期间大鼠粪便,应用GC法检测大鼠肠道菌群产生的短链脂肪酸(SCFAs)含量,与正常组相比,给药组大鼠肠菌液中乙酸、丙酸、丁酸含量均存在显著差异,且正常组高于给药组,尤其乙酸比例变化最为明显。综上所述,大黄总蒽醌长期给药造成大黄酸在肠道累积,肠内容物中乙酸、丙酸、丁酸含量降低,这可能与大黄泻下耐药及结肠黑变病的形成密切相关。