抗纤方对肺纤维化形成相关因子影响的实验研究

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目的:选取临床有效治疗肺纤维化的中老名医经验方,并提取制备。从SiO2、LPS诱导的肺纤维化动物模型及细胞模型探讨所选中药复方对肺纤维化形成的相关因子作用及分子机制。  方法:  1.制备药物:根据临床有效经验方,选取并通过以下方式制备。复方中药一、复方中药二、复方中药三、复方中药四。将所需药物清洗后,煮沸二次40min/次,滤液浓缩,用无水乙醇提取。另取健康猪脾除去外皮及脂肪组织,绞碎(无菌操作),反复冻融八次,超滤,提取转移因子。将转移因子按一定比例加入上述中药乙醇提取液中。最后“复方中药二”浓度为生药1 g/ml。转移因子浓度10mg/ml。其他药物制备同复方中药二,但不添加转移因子。  2.肺纤维化动物模型的建立:①SiO2诱导小鼠肺纤维化模型,以100mg/ml剂量的SiO2颗粒悬液,在小鼠吸入适量乙醚麻醉后经鼻腔滴入制作肺纤维化模型。分为空白对照组,模型组,药物组。连续造模三天,20天后可制备典型的肺纤维化模型。各药物组给予相应剂量药物治疗,21天后脱颈处死各组小鼠,western-blot、ELISA检测肺部组织相关蛋白P53、caspase-11及细胞因子IL-1β、TNF-α、IFN-α、LPS的表达含量。②LPS诱导小鼠肺纤维化模型,以1mg/ml剂量的LPS溶液,在小鼠吸入适量乙醚麻醉后经鼻腔滴入制作肺炎肺纤维化模型。分为空白对照组,模型组,药物组。连续造模三天可得到典型的LPS感染的模型,药物组给予相应剂量药物治疗。21天后脱颈处死各组小鼠,western-blot、ELISA检测肺部组织相关蛋白COL-Ⅰ、caspase-11及细胞因子IL-1β、TNF-α、IFN-α、LPS的表达含量。  3.巨噬细胞模型的建立:采用大鼠一次性腹腔注入1ml灭菌的100mg/ml的SiO2颗粒悬液,可建立巨噬细胞破坏的动物模型,ELISA检测腹腔灌洗液中细胞因子IL-1β、TNF-α、P53的表达量。  4.RAW264.7细胞模型:以SiO2颗粒刺激巨噬细胞RAW264.7,模拟肺部吞噬细胞吞噬SiO2颗粒形成矽肺纤维化的机制。同时制备含药血清,观察各药物组对巨噬细胞模型肺纤维化的影响,western-blot检测细胞P53、BCL-2表达情况。  结果:  1.在肺纤维化的动物模型中,ELISA的检测结果:①经SiO2诱导小鼠肺纤维化模型,与空白组相比,模型组与各药物组的IL-1β、TNF-α、IFN-α、LPS含量均上升,差异有统计学意义,说明造模成功。各药物组的IL-1β、TNF-α、IFN-α、LPS含量均显著低于其模型对照组,说明药物有显著性效果;②经LPS感染小鼠肺组织后,与空白组相比,模型组与各药物组的IL-1β、TNF-α、IFN-α、LPS含量均上升,差异有统计学意义,说明造模成功。各药物组的IL-1β、TNF-α、IFN-α、LPS含量均显著低于其模型对照组,说明药物有显著性效果。Western-blot的检测结果:①经SiO2诱导小鼠肺纤维化,与空白组相比,模型组与各药物组P53的灰度值均升高,但差异无统计学意义。与模型组相比,各药物组P53的灰度值均有下降趋势,其中中药复方三组较明显,但差异无统计学意义;与空白组相比,模型组与各药物组caspase-11的灰度值均升高,但差异无统计学意义。与模型组相比,各药物组caspase-11的灰度值均有不同程度下降,其中中药复方四组较明显,但差异无统计学意义;②经LPS感染小鼠肺组织后,与空白组相比,模型组与各药物组COL-Ⅰ的灰度值均升高,其中模型组P<0.05,具有统计学意义。与模型组相比,各药物组COL-Ⅰ的灰度值均有下降趋势,其中中药复方二组较明显,但差异无统计学意义;与空白组相比,模型组与各药物组caspase-11的灰度值均升高,其中模型组P<0.05,具有统计学意义。与模型组相比,各药物组caspase-11的灰度值均有不同程度下降,其中中药复方二组及中药复方四组caspase-11表达降低较显著。即在SiO2诱导小鼠肺纤维化形成中,中药复方四组阻止作用较显著。在LPS感染小鼠肺组织模型中,中药复方二组及中药复方四组对降低肺纤维化相关指标较明显。  2.在巨噬细胞模型中细胞因子的检测结果:SiO2颗粒刺激大鼠腹腔巨噬细胞后,与空白组相比,模型组IL-1β表达上升,但差异无统计学意义,与模型组相比,低剂量组的IL-1β高于模型组,中剂量组和高剂量组的IL-1β表达低于模型组,其中高剂量组值低于空白组;与空白组相比,模型组TNF-α表达上升,差异有统计学意义,与模型组相比,低剂量组、中剂量组和高剂量组的TNF-α表达均低于模型组,且表达量均低于空白组;与空白组相比,模型组P53表达上升,差异有统计学意义,与模型组相比,低剂量组、中剂量组和高剂量组的P53表达均低于模型组,其中高剂量组差异较明显。在SiO2颗粒刺激大鼠腹腔巨噬细胞的模型中,中药复方二的高剂量组对降低巨噬细胞凋亡相关的P53作用较明显。  3.在RAW264.7细胞模型中Western-blot的检测P53、Bcl-2结果:给予SiO2刺激后,RAW264.7巨噬细胞模型中:①凋亡蛋白P53在不同时间点表达有差异,其中在24h时间点时,P53表达高峰,48h时表达量降低,但仍高于12h的表达量;在同一时间点,12h时,模型组的凋亡蛋白P53表达量与不同剂量药物组表达量无明显差异;但在24h、48h时间点时,高剂量组凋亡蛋白P53表达量依次低于中剂量组、低剂量组、模型组,药物组内比较,虽有差别,但无统计学意义。②凋亡蛋白Bcl-2在不同时间点表达有差异,其中在12h时间点时,Bcl-2表达量最高;在同一时间点,12h时,模型组的凋亡蛋白Bcl-2表达量与不同剂量药物组表达无明显差异;但在24h、48h时间点时,与模型组相比,药物组凋亡蛋白Bcl-2量均高于模型组,且高剂量组凋亡蛋白Bcl-2表达量依次高于中剂量组、低剂量组。经综合比较,中药复方二组的高剂量组在SiO2刺激RAW264.7巨噬细胞模型中使P53表达下调及Bcl-2上调。  结论:从肺炎肺纤维化形成实验的数据统计结果分析,四组中药组方在阻止肺纤维化形成相关因子都有一定的治疗效果。其中作用较显著的为中药复方二组及中药复方四组。中药复方二组能够降低肺纤维化形成相关的炎症性因子如IL-1β、TNF-α,以及肺纤维化形成的相关凋亡蛋白P53、caspase-11和上调Bcl-2。中药复方四组能够降低肺纤维化形成相关的炎症性因子如IL-1β、TNF-α及caspase-11的表达。为中药复方二及中药复方四的临床应用提供了实验研究的依据。
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