花青素是一类参与多种生物过程的植物黄酮类色素。LDOX是花青素生物合成途径中的一个下游基因,它能够编码白花青素并将其转化为花青素。迄今为止,还没有研究阐明LDOX同源基因在棉花花青素合成及生长发育中的作用。本研究通过CRISPR-Cas9系统对棉花GhLDOX基因进行精准编辑创造靶向突变体,并通过超表达技术提高GhLDOX基因的表达量,从而对棉花GhLDOX基因进行功能鉴定。结果表明,无论是在营养组织中还是在花中,CRldox基因突变体植株都完全不含花青素,而OELDOX基因高表达植株则表现出总花青素的增加。且花青素含量的变化与GhLDOX基因表达量呈成正相关。此外,为了揭示花青素在棉花毛状体发育中的作用,我们对转GhLDOX基因的棉花植株进行了叶片表皮毛和种子纤维的检测。发现花色素苷的产生与叶片表皮毛及纤维的起始和伸长呈显著正相关。CRldox突变体中花青素的缺失叶片表皮毛和种子纤维的起始和伸长的显著,而OELDOX高表达株系花青素含量增加,叶片和纤维长度增加。通过对GhLDOX基因敲除的植株叶片进行转录组测序,结果表明参与黄酮类化合物生物合成途径的基因表达差异明显,其中大部分基因在无花青素样品中的FPKM值较低,表明这些基因的转录被下调。然而,只有少数几个基因上调表达,如Gh CHS、Gh4CL、Gh CCR和Gh CCAOMT。而在超表达植株中参与到黄酮类化合物生物合成途径的几个基因显著上调表达,如Gh4CL、Gh HCT、Gh C3H和Gh CCAOMT。这些结果表明,GhLDOX基因的抑制表达影响了大多数黄酮类化合物生物合成基因的转录水平,并与苯丙烷代谢路径的转录调控有关。同时,也对转基因植株的生长素水平进行了测定,结果表明转基因植株的生长素水平变化显著。无花青素突变体植株的叶片、胚珠和纤维中生长素含量显著降低,同时伴随着植物代谢产物的减少和表皮毛及纤维发育受到抑制。在超表达植株中,在纤维的起始阶段(0 DPA)和伸长阶段(20 DPA)IAA积累量提高。将激素测定的结果与我们的转录组数据相比较,证实了棉花中部分的生长素信号途径相关基因与花青素含量呈正相关。Gh ARF2和Gh ARF18,也称为吲哚乙酸诱导蛋白(IAA14 and IAA16),在GhLDOX转基因植物中差异表达。在无花色素的敲除(CRldox)植株中,这两个基因的表达量明显降低,相反,在超表达(OELDOX)植株中表现出较高的转录水平。我们的研究结果表明,GhLDOX基因编码的花青素蛋白在棉花生长素信号通路介导的表皮毛及纤维发育中具有一定的正调控作用。转录组数据表明在无花青素突变植株中,与光合活性相关的几种途径明显减少。基于KEGG功能富集分析,发现除光合作用途径外,卟啉和叶绿素代谢途径相关基因的转录也受到抑制。以上基因表达水平的降低与植物叶绿素含量的降低显著相关,并产生白化表现。这些结果表明,花青素色素可以通过平衡光系统强度来保护植物光合作用。花青素的缺乏会增加植物组织中的光氧化胁迫,从而导致光合作用的抑制。无花青素突变体中碳水化合物的减少是由于叶绿素含量低和花青素缺乏所致,有效碳源被认为是定向到不同的基质以补偿氮和碳资源的减少。无花色素突变体的糖含量显著降低,导致棉花表皮毛及纤维发育受阻,而棉花纤维是碳分配的主要源器官。此外,超表达植株还激活了卟啉和叶绿素的代谢、光合作用、碳固定和代谢途径以及氮代谢。根据以上数据,我们认为棉花GhLDOX基因是一个参与到棉花表皮毛发育的重要调控基因。因为植物类黄酮途径的系列产物在植物防御生物胁迫中具有重要作用.因此,我们对转GhLDOX基因的植株进行棉铃虫接虫并研究其行为特征。无花青素突变体比野生型更有利于棉铃虫幼虫的生长,而高表达株系对棉铃虫幼虫有较小的伤害。改变GhLDOX的表达能够调节类黄酮途径的代谢过程。因此,OELDOX转基因植物中类黄酮和棉酚含量的增加可能对棉铃虫的取食起到抑制作用。在植物与病原以及害虫长期斗争过程中,植物进化出由组成型和诱导型防御机制所构成的复杂网络来抵抗病原体及害虫的危害。植物细胞壁是第一道屏障,病原体及害虫的入侵必须克服这些屏障。传统观念认为植物细胞壁是一种屏障,其以动态的结构作为信号分子来触发植物的免疫反应。植物细胞壁还与病原菌相互作用,形成包括物理和化学机制在内的诱导性防御机制。另一方面,植物次生细胞壁赋予细胞壁刚性,从而加强了细胞壁的结构。因此,增强次生细胞壁可以提高植物的防御能力。植物木质化是一个动态的、灵活的过程,通过强化细胞壁来增强宿主防御系统抵御病原体入侵。木质素的生物合成途径在许多植物中有较为详细的描述,但在棉花中的研究还很有限。由于病虫害是制约棉花生产的主要因素之一,因此,通过调控木质素的生物合成加强转基因棉花对病虫害的防御能力,具有重要的理论和应用价值。一磷酸腺苷(AMP)结合域在许多植物中广泛存在,但其在植物发育和植病互作中的分子机制尚不清楚。本研究中,4-香豆酸:辅酶A连接酶(4CL)是木质素生物合成途径中具有AMP结合蛋白结构域的关键酶之一,并且通过病虫害感染下的木质素和苯丙烷途径对其在棉花防御系统中的作用进行了表征和验证。基于系统发育分析,在陆地棉基因组中共鉴定出35个4CL基因成员。其中一个(Gh4CL3)基因与拟南芥中的4CL3基因同源性较高。由于其与另外两个4CLs基因的特异性,Gh4CL3用来作进一步的研究。首先以GFP为报告基因进行亚细胞定位分析,发现Gh4CL3定位于细胞核和质膜。接下来,为了进行功能鉴定,我们利用CRISPR/Cas9系统对Gh4CL3基因进行靶向突变。并且成功地获得了3个独立的转化株系,分别命名为CR4CL-1、CR4CL-2和CR4CL-3。随后研究了Gh4CL3在棉花对黄萎病病菌大丽轮枝菌(V991)和棉铃虫(Helicoverpa armigera)处理下防御反应中的作用。结果表明,所有CR4CL3株系对病原菌和昆虫处理均具有超敏反应。敲除Gh4CL3基因导致木质素生物合成相关基因的表达量下调,从而导致棉花植株中的茎、根中木质素含量显著降低。实验结果表明木质素含量降低与水杨酸含量的增加、PR基因的高表达和类黄酮生物合成基因的低表达相关。同时,为了进一步证实基因敲除突变的表型,我们还通过农杆菌介导的遗传转化获得了三个独立的Gh4CL3超表达(over-expressing)棉花转基因单株,并命名为OE4CL-1、OE4CL-2和OE4CL-3。抗病实验结果表明,Gh4CL3超表达株系对真菌的抗性增强,且木质素在茎和根中的积累增加,类黄酮相关基因的表达量增加。综上所述,Gh4CL3通过木质素介导的免疫防御反应,在棉花抗生物胁迫中起着积极的调节作用。