肺癌的发病率和死亡率已经位居恶性肿瘤的首位。肺癌中85%是非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)。尽管近年来NSCLC患者的治疗已有了很大进步,然而患者的5年生存率依然仅有17%左右。肿瘤转移是造成肺癌患者死亡的主要原因。大量研究已经证明,循环肿瘤细胞(circulating tumor cells,CTCs)在肿瘤的远端转移中具有关键作用。CTCs是一个独立的标志物可预测肿瘤患者的生存,并且CTCs数量与肿瘤侵袭、转移以及患者复发时间之间存在关联。因此,对CTCs做深入研究不仅能促进我们进一步理解肿瘤转移的过程,并且能发展新的临床诊断手段以指导肿瘤的治疗策略,使得患者在提高生存质量和延长生存期上受益。目前,基于CTCs的研究及其临床应用还面临着诸多难题。首先,外周血中CTCs的数量极少,研究CTCs的前提是首先分离和富集出CTCs。目前的富集并鉴定CTCs的技术大多依赖上皮细胞粘附分子(epithelial cell adhesion molecule,EpCAM),其中代表性的富集平台就是Cellsearch——唯一通过美国FDA认证的CTCs检测系统。然而,肿瘤细胞在转移过程中会发生上皮-间质转化(epithelial mesenchymal transition,EMT),该生物学过程已经被证明是肿瘤发生侵袭和转移的重要机制。在EMT过程中,CTCs表面的EpCAM表达下调,甚至丢失。所以,基于EpCAM富集CTCs的方法将严重低估CTCs的数量并可能导致错误的临床假设和结论。因此,对于CTCs的检测应该包括发生了 EMT的这一重要的功能型CTCs亚群。然而,到现在为止,还不清楚发生EMT后EpCAM下调(或丢失)的CTCs所具有的生物学特性。但是,这类CTCs已被国际权威专家预测具有更大的临床诊断价值。因此,分离出全部类型的CTC并鉴定其与EMT的关系将能可能发掘CTC在临床应用中新价值。此外,近来的研究进一步显示,随着EMT的发生,肿瘤细胞呈现肿瘤干细胞样(stem cell-like)的特性,而肿瘤干细胞已经被证明是肺癌的起源。但是还不清楚发生EMT的CTCs与肿瘤干细胞之间的关系。进一步研究上述问题将为揭示肺癌转移的过程和机制提供有价值的信息。其次,CTCs临床应用的另一个难题来自于其复杂的生物学特性。单细胞分析技术的发展和应用已经证明了 CTCs之间存在显著的异质性。肿瘤干细胞假说认为,仅有少数的肿瘤细胞具有转移潜能,这些细胞从原发灶脱落到经血循环运送到远端,最终成功存活,适应适应微环境后增殖克隆形成转移灶。因此,并不是所有的CTCs都具有临床相关性。所以,CTC研究的一个主要目标是能够从CTCs中识别出这些真正能够形成转移的亚群细胞。因此,需要对CTCs进行生物学功能研究,筛选出能够表征具有肿瘤干性CTCs亚群的标志物。在对乳腺癌CTCs的研究中,已经识别出了一个可能的肿瘤干细胞亚群的表型,该亚群具有更高的转移效率,而相关研究在NSCLC中还未见报道。本研究主要包括两方面的内容。一是我们探索了肺癌患者外周血中表达与不表达EpCAM的CTC所具有的临床价值。通过阴性-磁性分离法分离NSCLC患者外周血中的CTCs,获得全部类型的CTCs,然后根据目前普遍使用的标志物,即EpCAM和细胞角蛋白(Cytokeratin,CK)分类检测CTCs,探索不同CTC亚群细胞的临床意义。本研究收集了 47例NSCLC患者的外周血样品各7.5ml,其中3例患者在每一治疗周期结束时采集外周血样品用于动态监测CTCs,经EpCAM和CK免疫荧光染色后,流式细胞仪鉴定CTCs并计数。结果显示,表达 EpCAM 的 CTCs 检出率分别为 64.3%(9/14,Ⅰ-Ⅱ 期)、40.0%(4/10,Ⅲ期)和43.5%(10/23,Ⅳ期),不表达EpCAM的CTCs检出率分别为78.6%(11/14,Ⅰ-Ⅱ 期)、90.0%(9/10,Ⅲ 期)和 91.3%(21/23,Ⅳ 期),两类 CTCs 在 Ⅳ 期的检出率具有显著性差异(P=0.001)。不表达EpCAM的CTCs数量在各期均显著高于表达EpCAM的CTCs数量(均P＜0.05);在Ⅳ期患者中,不表达EpCAM的CTCs数量百分比大于90%的患者出现频率显著高于Ⅰ-Ⅱ期的患者(P=0.030),而百分比在50～90%之间的患者出现频率显著低于Ⅰ-Ⅱ期的患者(P=0.001)。动态监测结果显示,不表达EpCAM的CTCs数量的百分比大于50%时患者的治疗普遍无效(P=0.033)。以上这些结果表明,在NSCLC患者的外周血中显著存在一类不表达EpCAM的CTCs,并且不表达EpCAM的CTCs影响NSCLC的远端转移和疗效。因此,对EpCAM表达水平不同的CTCs做进一步分类将有助于评估NSCLC患者的远端转移和治疗疗效。二是通过肺癌细胞系,探索了 EMT与肿瘤干性之间的关系,并以此为基础筛选功能性标志物,为后续发展一类新的功能性CTCs应用于临床提供理论依据。在前期研究中,我们发现在肺癌患者中,趋化因子受体4(chemokine receptor 4,CXCR4)表达阳性的CTC主要存在于不表达EpCAM的亚群中,而NSCLC的耐药CXCR4阳性亚群具有肿瘤干细胞样的特性。为了进一步探索这类CTC亚群的分子特点,我们从细胞系入手,对CXCR4表达阳性的耐药肺癌细胞系进行了 EMT特征分析,以筛选出同时具有EMT及干细胞样特性的分子标志物。本次研究首先构建了发生EMT的细胞系(A549/TGF-β1)和吉非替尼耐药细胞系(A549/GR),随后通过EMT RT2 Profier PCR Array检测两种细胞84个EMT相关mRNA的表达情况,cBio Cancer Genomics Portal网站的TCGA数据库和Gene Network Central(GNC)ProTutorial网站分别被用来分析候选标志物的临床意义和通路情况。结果显示,CXCR4在TGF-β1诱导的EMT以及吉非替尼耐药过程中表达均上调。在84个检测的mRNA基因中,有66个mRNA基因在经TGF-β1诱导发生EMT的A549/TGF-β1细胞中表达上调,11个mRNA基因表达下调,7个mRNA基因表达不变。另外,在耐药的CXCR4阳性亚群细胞中,有17个mRNA基因表达上调,21 mRNA基因表达下调,46个mRNA基因表达没有变化。在两个生物学过程中,mRNA基因表达水平均上调的有14个,分别为(ITGA5,BMP7,MMP3,VIM,RGS2,ZEB2,TCF3,SNAI2,VCAN,PLEK2,WNT5A,COL3A1,SPARC和FOXC2)。Kaplan-Meier生存分析结果显示在双上调的mRNA基因中,ITGA5、RGS2、SNAI2和PLEK2这4个mRNA与肺腺癌患者的总体生存期相关(P<0.05)。在GNC网站上的通路分析结果显示,SNAI2与CXCR4在信号通路存在共表达,而ITGA、RGS2以及PLEK2这3个mRNA基因相对独立于CXCR4的信号通路。吉非替尼耐药过程中CXCR4的上调与EMT之间存在信号通路的交互,这为后续发展一类新的具有生物学功能的CTCs亚群用于临床诊断提供新思路。本研究从特性鉴定CTCs入手,一方面证明了分类检测NSCLC患者外周血中的CTCs有助于对患者的疾病进展和治疗疗效进行评估。另一方面,通过对具有肿瘤干细胞样特性的CXCR4阳性肺癌耐药细胞进行EMT的特性分析,得到了具有临床价值的标志物,这为将来进一步的CTCs生物学功能鉴定研究及临床应用提供了依据。