一、研究背景、目的与意义　　 支气管哮喘(后文简称哮喘)是肥大细胞、嗜酸性粒细胞、T淋巴细胞、巨噬细胞、中性粒细胞和上皮细胞等多种细胞和细胞介质参与的呼吸道慢性炎症。在我国哮喘是严重影响人们(特别是儿童和青少年)健康的常见病,据粗略统计,我国约有1500万～2000万人罹患哮喘。随着城市化,现代生活的进步,近几年来哮喘患病率有增加的趋势,在我国广州,1994-2001年间,13-14岁有哮喘症状的儿童患病率由3.4％增加至9.9％。由于哮喘病情常迁延反复,病程长,故已成为世界性的健康问题而引起各国的极大关注。近年研究发现,哮喘的发生不仅存在着气道炎症,还存在着不同程度的气道壁结构改变,即气道重构,气道炎症与气道重构是哮喘的两个主要病理学特征。其中气道重构是引起慢性哮喘患者气道不可逆性阻塞的病理基础。气道炎症是哮喘产生高反应的本质因素。　　 环氧化酶2在炎性反应环节中起着关键作用,已视为快速炎症反应的重要标志之一。COX-2主要存在于气道上皮细胞和平滑肌细胞,生理状态下它几乎不被表达,只有在炎性细胞因子或炎性介质将细胞激活的情况下才被表达。哮喘患者气道粘膜中有大量的单核-巨噬细胞、嗜酸性粒细胞及中性粒细胞浸润,被激活后可产生大量的COX-2,COX-2是种炎性酶,它的表达诱导多种炎症介质的表达,这些炎症介质又加重了炎症反应,从而诱发哮喘或使哮喘加重。　　 细胞外基质(ECM)的降解和沉积失衡是导致哮喘患者气道壁结构异常构建、肺实质破坏及间质增生的重要因为。研究发现基质金属蛋白酶(MMPs)是调节ECM代谢的主要限速酶。MMP-9是MMP家族的成员之一,正常状态组织表达极少。在细胞因子刺激下MMP-9表达上调,细胞外基质降解,导致气道慢性炎症和气道重塑。哮喘患者MMP-9表达过度,气道细胞外基质受损,炎细胞向气道局部浸润,激活基质的生长因子,促进成纤维细胞增生、胶原沉积,最终引起气道重塑,加重气道炎症。从而引起了哮喘的产生或加重了哮喘。　　 中医认为哮喘病属于“哮病”范畴,穴位贴敷疗法是中医治疗此病的较有效疗法之一。穴位贴敷法古称“冷灸”,是把药物研成细末,用液体(如水、醋、酒、蛋清、植物油、姜汁等)调成糊状,或将中药熬成膏剂,直接贴敷于穴位。穴位贴敷作为外治疗法,对人体的作用机理主要包括药物的直接作用和药物对俞穴刺激的间接作用两方面。此种疗法为中医治疗哮喘的常用疗法之一,虽疗效显著但剂型落后。目前,有一种较新的项目一经皮给药系统,(TDDS),其是药物经由皮肽吸收进入人体血液循环并达到有效血药浓度、实现疾病治疗或预防的一类制剂。这类制剂在欧美国家习称为贴剂,在国内多定名为贴片,这种剂型较原有穴位贴敷剂型具有药物吸收快、生物利用度高、携带方便等特点。本实验观察了穴位贴敷经皮给药药贴对哮喘豚鼠血清中COX-2水平的影响以及对哮喘豚鼠支气管肺组织中MMP-9影响,从而探讨穴位贴敷经皮给药药贴对治疗哮喘的可能作用机制,并为今后TDD药贴在临床上推广应用提供理论依据。　　 二、方法与内容　　 1.实验动物与分组　　 48只豚鼠,随机分为正常对照组、模型组、TDD药贴组和地塞米松组,每组各12只。　　 2.实验方法　　 2.1致敏:除正常对照组外,其余各组均采用鸡卵白蛋白致敏,常规消毒后一次性腹腔注射100 g/L卵白蛋白生理盐水1mL,使豚鼠处于致敏状态。第18天开始,将致敏的豚鼠置于密闭透明的塑料盒内,给予10 g/L卵白蛋白生理盐水浑悬液雾化吸入加以激发,每次每次30 s,1次/d,连续14d以腹式呼吸明显,呼吸频率加快且节律不整,活动减少等症状为诱喘成功。正常对照组以生理盐水代替卵白蛋白生理盐水,其致敏及诱喘时间同实验组。　　 2.2治疗:TDD药贴组将TDD药贴敷贴于豚鼠大椎、双肺俞、双肾俞进行治疗。地塞米松组采用穴腹腔注射地塞米松进行干预治疗。模型对照组和正常对照组不给予任何干预治疗。观察各组豚鼠哮喘发作时的症状轻重程度以及发作次数。　　 2.3取材及制作标本:在末次诱喘后2～4 h内,给豚鼠称体质量,用30g/L戊巴比妥钠,按50 mg/kg腹腔注射麻醉豚鼠,迅速断头取血,每只取5 mL,然后室温放置2 h后,3000 r/min离心15 min,取上清液,放冰箱-20℃保存待测。在断头取血同时,立即迅速打开胸腔,暴露肺及心脏,常规取支气管肺组织(右中下肺,包括肺门),避免钳夹组织引起组织受压影响观察,取材部位:右中下肺取一横切面,包括肿门。所取组织经100ml/L多聚甲醛固定,常规石蜡包埋和切片(厚4 um),等待测量。　　 2.4指标检测:实验结束后,采用酶联免疫吸附法定量检测每只豚鼠血清中COX-2水平,采用免疫组化法测定支气管肺组织MMP-9蛋白表达。　　 2.5统计方法:所有实验数据均在SPSS 13.0上建立数据库、进行数据录入与统计分析。各组间差异采用单向方差分析(One-WayANOVA),方差齐用LSD检验,方差不齐用Tamhane’s检验。　　 2.6分析数据,得出结论。　　 三、结果　　 1.在造模及治疗阶段:TDD药贴组死亡6只,模型组死亡6只,地塞米松组死亡4只,正常对照组死亡豚鼠2只。　　 2.穴位贴敷TDD药贴对哮喘豚鼠血清中COX-2水平的影响　　 采用酶联免疫吸附法定量检测血清中COX-2含量的结果表明:模型对照组豚鼠血清中cox-2含量显著高于正常对照组(P<0.01,P值0.000),说明哮喘豚鼠血清中COX-2含量显著增加,即造模成功,也表明血清中COX-2含量与哮喘密切相关。TDD药贴组、地塞米松组豚鼠血清COX-2含量显著低于模型对照组(P<0.01,P值0.000),说明两种治疗方法均可使哮喘豚鼠血清中COX-2水平降低。而TDD药贴组豚鼠血清中COX-2的水平与地塞米松组相比有差异(P<0.01,P值0.004),说明地塞米松腹腔注射的方法比TDD贴敷更能降低哮喘豚鼠血清中COX-2水平。　　 3.穴位贴敷TDD药贴对哮喘豚鼠支气管肺组织中MMP-9水平的影响　　 采用免疫组化法测定支气管肺组织MMP-9蛋白表达结果显示:模型对照组豚鼠支气管肺组织中MMP-9水平高于正常对照组(P<0.01,P值0.000)。经皮给药药贴组、地塞米松组豚鼠MMP-9水平低于模型对照组(P<0.01,P值0.000)。经皮给药药贴组、地塞米松组豚鼠血清MMP-9水平稍高于正常对照组(P<0.01,P值0.000)。经皮给药药贴组与地塞米松组豚鼠MMP-9平相当,差异无显著性意义(P>0.05,P值0.074),说明这两种干预措施对哮喘豚鼠支气管肺组织中MMP-9水平影响无差异。　　 四、结论　　 穴位贴敷TDD药贴有效的降低了豚鼠血清中COX-2水平及支气管肺组织中MMP-9水平,从而抑制了气道炎症,降低气道高反应性,减少哮喘发作的次数,减轻哮喘发作症状。