背景及目的:结直肠癌（colorectal cancer,CRC）被认为是当今全球最常见的威胁人类生命健康的恶性肿瘤之一^[1]。结直肠癌每年的发病率和死亡率在所有恶性肿瘤当中都高居前列。根据最新的流行病学统计,全世界每年都有超过60万患者死于结直肠癌,流行病学调查研究显示超过90%的患者的死亡原因是由于肿瘤的远端转移引起的^[2]。因此,如何及早的发现及早期干预治疗,对于降低结直肠癌患者的死亡率及预后生存质量具有重要的意义。随着基因组学和转录组学的研究发展,不断深入的研究证实长链非编码RNA（long non-coding RNA,lncRNA）在多种疾病,尤其是在多种恶性肿瘤的发生发展的过程中扮演重要的角色^[3-6]。lncRNA是一种最近被研究证实的具有特定调控功能的RNAs,lncRNA长度大于200个碱基,由于缺乏明显的开放阅读框而不具备编码蛋白质的功能^[7]。目前对于lncRNA的研究手段包括:长链非编码RNA芯片^[8]、RNA-seq^[9]、以及被广泛认可的The Cancer Genome Atlas（TCGA）数据库^[10],Gene Expression Omnibus（GEO）数据库^[11]。lncRNA在结直肠癌的发病机制中的研究随着技术手段的不断提升,研究数量的不断增大而不断深入,对于探究lncRNA在结直肠癌中的分子作用机制有了不断的提升。但是,目前对于lncRNA在结直肠癌中的表达特征缺乏系统性的分析,大多数研究仅仅通过样本量较少的组织学芯片或者RNA-seq来对lncRNA在结直肠癌组织中的表达特征进行单一的研究,对于数量巨大的lncRNA,没有全面而系统性的表达特征的研究。本研究旨在通过结直肠癌组织进行人类长链非编码RNA芯片筛查,结合TCGA数据库中506例结直肠癌患者组织学RNA-seq的原始结果,以及GEO数据库中三张结直肠癌组织样本数量较大的人类lncRNA芯片的联合分析,对lncRNA在结直肠癌组织中的表达特征有一个全面而具体的描述,对这些表达异常的lncRNA、mRNA进行表达水平及参与的肿瘤发展过程进行细致的研究。其次,本研究通过大样本组织进行qRT-PCR对上述分析结果进行了验证,筛选出新的与结直肠癌发生发展密切相关的lncRNA LINC02595,基于目前尚未有针对LINC02595在包含肿瘤在内的任何疾病中的相关报道,我们继续对LINC02595在结直肠癌进展中的生物学功能以及作用机制进行了细胞内及裸鼠体内的相关实验,对其分子学作用机制进行了深入探讨研究。lncRNA在很多疾病,包括恶性肿瘤,可以作为一种Biomarker具有很广泛的应用前景。而目前对于结直肠癌在这方面的研究尚处于起步阶段,本研究对CRC患者的肿瘤组织、IBD患者的炎症组织、CRC患者的外周血浆中的表达水平的研究,试图寻找与结直肠癌早期诊断密切相关的lncRNA Biomarker,为结直肠癌的早期发现及干预提供诊断支持。研究对象:生物信息学分析包含来自TCGA数据库506例CRC患者的组织的RNA-seq的原始数据,GEO数据库中GSE110715,GSE109454,GSE70880三张组织lncRNA芯片原始数据;人类lncRNA芯片研究包含5例诊断明确的CRC患者的肿瘤组织及配对的癌旁组织;对LINC02595、miR-203b-3p、BCL2L1进行qRT-PCR验证的116例诊断明确的CRC患者的肿瘤组织及配对的癌旁组织,21例炎症性肠病患者炎症组织及15例配对的正常组织;对LINC02595作为临床早期诊断CRC的biomarker的研究包括30例诊断明确的CRC患者,及25例健康体检人群的血浆样本。上述所有组织及血浆样本均来自中国医科大学附属第一医院,所有研究对象均签署知情同意书,本研究同时获得了中国医科大学附属第一医院伦理委员会批准。研究方法:1、人类长链非编码RNA芯片分析（1）通过5例诊断明确的CRC患者肿瘤组织及配对的癌旁组织进行人类长链非编码RNA芯片分析,以Fold Change（FC）>2,P<0.05为标准;（2）对差异mRNAs进行Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG）、Gene Ontology（GO）分析,探究与肿瘤进展相关的信号通路及细胞生理过程;（3）qRT-PCR检测芯片分析结果中表达差异最显著的12个lncRNA在10例诊断明确的CRC患者肿瘤组织及配对癌旁组织中的表达水平。筛选出与结直肠癌密切相关的lncRNA作为下一步分析目标。2、TCGA数据库结直肠癌患者RNA-seq数据分析（1）下载TCGA数据库中CRC患者的RNA-seq数据。入选标准:包含完整的临床病理资料,随访时间大于等于30天。（2）运用R语言对入选的506例CRC患者的原始数据进行表达水平的差异性分析,以FC>2,P<0.05为标准;（2）对差异mRNAs进行GO及KEGG分析,探究与肿瘤进展相关的信号通路及细胞生理过程;3、GEO数据库结直肠癌患者芯片数据分析GEO数据库表达谱的组织芯片（GSE110715,GSE109454,GSE70880）数据用R语言进行联合分析,筛选差异表达的lncRNA。4、评估LINC02595作为结直肠癌诊断标记物的能力（1）qRT-PCR检测LINC02595在116例诊断明确的结直肠癌患者肿瘤组织及配对癌旁组织中的表达水平;同时将LINC02595表达水平与患者临床病理资料联合分析;（2）qRT-PCR检测LINC02595在21例炎症性肠病患者病变组织及15例配对的正常组织中的表达水平;（3）qRT-PCR检测LINC02595在30例诊断明确的结直肠癌患者血浆样本及25例健康体检者血浆样本的表达水平;通过ROC曲线评估其作为结直肠癌早期诊断指标的能力。5、LINC02595在结直肠癌细胞中生物学功能评估（1）qRT-PCR检测LINC02595在CRC常见细胞系中的表达水平,根据表达水平高低挑选两株细胞（HT29、RKO）作为后期敲减实验对象,挑选HCT116作为后期过表达实验对象,敲减使用锐博生物提供的Smart Silencer,过表达使用汉恒生物的过表达质粒;（2）CCK8及克隆形成实验评估LINC02595对CRC细胞增殖水平影响;（3）流式凋亡检测、Western Blotting（Bax、Bcl2、Survivin）评估LINC02595对CRC细胞凋亡能力的影响;（4）流式周期检测、Western Blotting（CDK4、CDK6）评估LINC02595对CRC细胞周期的影响;（5）为了构建稳转细胞系,本研究使用慢病毒转染HT29,裸鼠成瘤实验评估LINC02595在体内对CRC发生发展的影响（瘤体大小、瘤体肿瘤、瘤体中LINC02595表达水平、HE染色、免疫组化检测Ki-67）;6、LINC02595在CRC发生发展过程中作用的机制研究（1）两株细胞系（HT29、RKO）进行核质分离及RNA-FISH确定LINC02595的细胞定位;（2）DIANA tools在线预测与LINC02595存在结合位点的mi RNA,得分最高的三个miRNA为miR-4715-3p,mi R-3942-3p,miR-203b-3p;（3）构建包含三个miRNA结合位点的野生型LINC02595质粒,双荧光素酶报告基因实验进行验证（结果显示miR-203b-3p阳性）;进一步构建mi R-203b-3p结合位点的突变质粒进行验证;（4）qRT-PCR检测miR-203b-3p在116例诊断明确的CRC患者肿瘤组织及配对癌旁组织中的表达水平;Pearson’s correlation analysis分析116例CRC患者miR-203b-3p及LINC02595表达水平相关性;（5）qRT-PCR检测miR-203b-3p在结直肠癌患细胞系中的表达水平;筛选一株细胞系（HT29）进行生物功能实验（敲减使用锐博生物提供inhibitor,过表达使用锐博生物提供mimic）;（6）CCK8实验、流式凋亡检测、流式周期检测等实验检测mi R-203b-3p对CRC细胞增殖、凋亡、周期水平的影响;（7）共转染后CCK8、流式凋亡、流式周期检测mi R-203b-3p是否可以逆转LINC02595生物学功能影响;（8）使用mi RDB,miRTarBase,Target Scan,对mi R-203b-3p的靶基因进行了预测,取交集;（9）TCGA数据库506例CRC患者以LINC02595表达水平中位值分为High-LINC02595组及Low-LINC02595组,对两组人群差异表达mRNA进行GSEA分析,P<0.05判断富集的信号通路,结合miR-203b-3p靶基因预测,挑选靶基因;（10）双荧光素酶报告基因实验确认生物信息学预测结果;（11）检测分别敲减/过表达LINC02595或miR-203b-3p后靶基因在mRNA水平及蛋白水平的变化趋势;（12）Rescue实验验证LINC02595/miR-203b-3p/BCL2L1作用轴调控关系;（13）qRT-PCR检测BCL2L1在116例诊断明确的CRC患者肿瘤组织及配对癌旁组织中的表达水平;qRT-PCR检测BCL2L1在结直肠癌细胞系中的表达水平;免疫组化检测BCL2L1在CRC患者石蜡切片中蛋白水平的表达水平;Pearson’s correlation analysis分析116例CRC患者BCL2L1及LINC02595表达水平相关性;研究结果:1、生物信息学分析结果（1）以FC≥2,P<0.05为标准,人类长链非编码RNA芯片差异分析结果显示940个差异表达lncRNAs（236个表达上调,620个表达下调）,2395个差异表达mRNAs（1500个表达上调,895个表达下调）;（2）差异mRNA Gene Ontology（GO）和KEGG Pathyway分析结果显示,多个与肿瘤发生发展相关的通路及细胞生理过程有意义（包括细胞周期、RNA结合、细胞因子、P53信号通路等）P<0.05;（3）TCGA数据库506例CRC患者RNA-seq数据分析结果显示:869个表达上调的mRNAs和756表达下调的mRNAs,622个表达上调的lncRNAs和201表达下调的lncRNAs;GO及KEGG富集结果同样发现多个与肿瘤发生发展相关的通路及细胞生理过程有意义,P<0.05;（4）qRT-PCR检测芯片分析结果中表达差异最显著的12个lncRNA在10例诊断明确的CRC患者肿瘤组织及配对癌旁组织中的表达水平结果显示结果与芯片结果相一致,同时结果发现LINC02595表达差异最显著,P<0.05;（5）TCGA数据库患者配对组织及非配对组织中LINC02595表达水平分析结果显示LINC02595在肿瘤组织中表达水平显著升高,P<0.05;（6）GEO数据库芯片联合分析显示LINC02595表达水平在肿瘤组织中显著升高,P<0.05;2、LINC02595在CRC、IBD组织及CRC患者血浆中的表达水平及作为CRC患者早期血浆诊断标记物评估结果分析（1）116例CRC患者,与配对癌旁组织相比,LINC02595在肿瘤组织中的表达水平显著升高,P<0.05;LINC02595表达水平与临床病理资料联合分析结果显示LINC02595表达水平与浸润深度（P=0.039）,淋巴结转移（P=0.011）及远端转移（P=0.019）密切相关,与病人年龄、性别、肿瘤位置无统计学差异（P>0.05）;（2）与正常肠上皮相比,LINC02595在IBD患者炎症组织中的表达水平显著升高,P<0.05;（3）与健康体检者血浆中LINC02595的表达水平相比较,LINC02595在CRC患者血浆中的表达水平显著升高,P<0.05;（4）ROC曲线分析,当cutoff值为4.29时,曲线下面积为0.781,敏感性和特异性为0.667和0.84,P<0.05。3、LINC02595促进细胞增殖、抑制细胞凋亡、促进细胞周期进展（1）与正常肠上皮比较,LINC02595在6株常见CRC细胞系中的表达水平显著升高,P<0.05;（2）与NC组比较,转染Smart Silencer之后,CCK8及克隆形成实验结果显示:HT29、RKO细胞系增殖能力显著降低,P<0.05;转染过表达质粒之后,HCT116细胞增殖能力显著升高,P<0.05;（3）与NC组比较,转染Smart Silencer之后,流式凋亡及Western Blotting结果显示:HT29、RKO细胞系凋亡水平显著升高,P<0.05;转染过表达质粒之后,HCT116细胞凋亡水平显著降低,P<0.05;（4）与NC组比较,转染Smart Silencer之后,流式周期检测及Western Blotting结果显示:HT29、RKO细胞系阻滞在G0/G1期,活跃的S期细胞也明显减少,P<0.05;转染过表达质粒之后,HCT116细胞G0/G1期细胞数目显著下降,S期细胞增多,P<0.05;4、裸鼠成瘤实验结果显示:与NC组比较,sh-LINC02595组小鼠的瘤体大小显著减小,P<0.05;重量减轻,P<0.05;HE染色及免疫组织化学染色Ki-67的表达水平结果显示与NC组相比,sh-LINC02595组Ki-67表达水平明显低于对照组P<0.05;5、HT29、RKO细胞核质分离及RNA-FISH实验结果显示:LINC02595主要分布在细胞质当中;6、LINC02595通过竞争性抑制miR-203b-3p发挥作用（1）DIANA在线生物信息预测显示miR-3942-3p,miR-4715-3p,miR-203b-3p与LINC02595存在结合位点,且评分最高;（2）双荧光素酶报告基因实验结果显示只有mi R-203b-3p与LINC02595发生特异性结合,P<0.05;（3）qRT-PCR检测116例CRC患者配对组织及常见CRC细胞系中miR-203b-3p表达水平,结果显示:与癌旁组织相比,肿瘤组织中mi R-203b-3p的表达水平显著降低,P<0.05;Pearson’s correlation分析LINC02595与miR-203b-3p呈现负相关,r=-0.323,P<0.05;CRC细胞系中的表达水平也显著降低,P<0.05;（4）生物学功能实验结果显示,与NC组比较,转染miR-203b-3p mimic之后HT29细胞增殖能力下降,凋亡比例显著上升,G0/G1期细胞数目显著增多,P<0.05;转染miR-203b-3p inhibitor之后,HT29细胞的增殖能力显著上升,凋亡比例显著降低,G0/G1期细胞数目显著降低,P<0.05;7、miR-203b-3p可以逆转LINC02595生物学功能,（1）CCK8实验结果显示miR-203b-3p inhibitor可以拯救LINC02595 smart silencer所导致的HT29细胞增殖水平下降,P<0.05;（2）流式细胞仪检测HT29凋亡水平变化,分析结果显示miR-203b-3p inhibitor可以拯救LINC02595 smart silencer所导致的HT29细胞凋亡水平上升,P<0.05;（3）流式细胞仪检测HT29周期变化,分析结果显示miR-203b-3p inhibitor可以拯救LINC02595 smart silencer所导致的HT29细胞G0/G1期细胞数目增多,P<0.05;8、LINC02595通过竞争性抑制miR-203b-3p促进BCL2L1的表达（1）通过三个数据库预测miR-203b-3p靶基因,发现共有11个基因共同存在于这三个数据库（MRPS5,YWHAE,ACBD3,PTP4A1,TBC1D8B,BCL2L1,ERI2,RBFOX2,GAN,SHOC2,DDHD1）。我们对这11个基因通过TCGA数据库进行了表达量分析,结果发现只有MRPS5,YWHAE,ACBD3,PTP4A1,TBC1D8B,BCL2L1,ERI2这7个基因在结直肠癌肿瘤组织中呈现低表达,P<0.05;（2）TCGA数据库GSEA分析结果显示高表达LINC02595相关KEGG富集结果在NF-κB信号通路,P<0.05;将NF-κB信号通路中的作用位点与上述5个靶基因联合分析发现BCL2L1是一个重要的作用位点;（3）双荧光素酶报告基因实验结果显示BCL2L1与miR-203b-3p存在特异性结合,P<0.05;（4）qRT-PCR检测mRNA水平,Western Blotting检测蛋白水平,结果显示:与对照组相比,当我们过表达miR-203b-3p后,BCL2L1的表达水平显著降低,P<0.05;当我们抑制miR-203b-3p之后,BCL2L1的表达水平显著升高,P<0.05;（5）qRT-PCR检测mRNA水平,Western Blotting检测蛋白水平,结果显示:与对照组相比,当我们敲减LINC02595后,BCL2L1的表达水平显著降低,P<0.05;当我们过表达LINC02595之后,BCL2L1的表达水平显著升高,P<0.05;（6）Rescue实验结果显示:与单独转染LINC02595过表达质粒组相比,共转染miR-203b-3p mimic后,可以有效逆转因LINC02595过表达质粒引起的BCL2L1蛋白表达水平上升,P<0.05;但是在MT-LINC02595质粒并没有检测到任何变化,P>0.05;在另一组当中,我们发现,与单独转染LINC02595 smart silencer相比较,共转染miR-203b-3p inhibitor之后,可以拯救因沉默LINC02595而导致的BCL2L1蛋白下降,P<0.05;9、qRT-PCR检测BCL2L1在116例诊断明确的结直肠癌患者肿瘤组织及配对癌旁组织、结直肠癌细胞系中的表达水平结果显示:与癌旁组织相比,肿瘤组织中BCL2L1的表达水平显著升高,P<0.05;与正常肠上皮组织相比,BCL2L1在结直肠癌细胞系中的表达水平均显著升高,P<0.05;10、免疫组化检测BCL2L1表达水平结果显示:BCL2L1在肿瘤组织中的表达水平显著升高,P<0.05;11、Pearson’s correlation analysis结果显示:LINC02595与BCL2L1二者表达水平存在正相关,r=0.769,P=6.248e-24。结论:1、人类长链非编码RNA芯片分析、TCGA数据及GEO数据库生物信息学分析显示众多差异表达的lncRNA在CRC的发生发展过程中发挥重要功能,参与多个肿瘤相关信号通路及细胞生理过程,这对描绘lncRNA在CRC组织中的表达特征具有重要意义,并对继续深入研究lncRNA的功能及分子学机制提供了指导作用;2、LINC02595在CRC患者肿瘤组织当中高表达,具有促进细胞增殖、抑制细胞凋亡及促进细胞周期进展的作用;3、LINC02595的分子学作用机制主要为竞争性结合miR-203b-3p协同促进BCL2L1的表达,实现对结直肠癌发生发展的调控作用,这一作用轴在CRC的诊断及靶向治疗方面具有潜在临床意义。