目的:1.铁皮石斛是石斛的主流商品药材,用途广,需求量大,生长条件特殊,资源紧缺,价格昂贵,已被《中国植物红皮书》列为濒危珍稀植物。为了解决铁皮石斛资源紧缺的难题,本文对组培铁皮石斛与铁皮石斛进行了品质评价研究,旨在为组培铁皮石斛替代铁皮石斛提供理论依据,满足市场需求。2.本文对组培铁皮石斛进行了生药学研究,通过与市售铁皮石斛(商品称铁皮枫斗)的形态学与化学成分分析比较,以探求组培铁皮石斛与市售铁皮枫斗的品质相关性。3.本文对组培铁皮石斛进行了较系统的药效学研究,通过组培铁皮石斛与市售铁皮枫斗的抗疲劳、耐缺氧、抗辐射、体外抗氧化及抗肿瘤作用比较,以确定两者药效学特征的相关性,为该品种开发提供科学资料。材料与方法:1.材料:铁皮石斛胚状体、铁皮石斛组培苗及市售铁皮枫斗。2.方法:(1)通过数码拍照及显微摄相技术对铁皮石斛胚状体、铁皮石斛组培苗及市售铁皮枫斗进行形态学比较,包括对其性状特征与显微特征的比较;(2)通过紫外分光光度法、茚三酮柱后衍生法和原子吸收分光光度法对3种铁皮石斛药材进行化学成分分析,包括多糖、生物碱、纤维素、氨基酸、微量元素含量比较。(3)通过体内实验法(包括紫外分光光度法、二乙酰―肟法等)对组培铁皮石斛进行抗疲劳、耐缺氧、抗辐射研究,并通过体外实验法(包括清除羟自由基法、邻苯三酚自氧化法、MTT比色法等)对组培铁皮石斛进行抗氧化及抗肿瘤作用的研究。结果:1.形态学研究:(1)宏观特征:3种铁皮石斛药材由于生长条件不同,宏观特征存在较大差异,但气味基本一致。(2)显微特征:铁皮枫斗药材粉末特征明显,包括茎表皮细胞、非腺毛、草酸钙针晶束等,铁皮石斛组培苗粉末特征有较小草酸钙针晶束,铁皮石斛胚状体粉末中未见明显的显微特征。2.化学成分比较研究:(1)多糖含量:铁皮枫斗含量最高(16.67%)>铁皮石斛胚状体(11.57%)>铁皮石斛组培苗(6.42%)。(2)总生物碱含量:铁皮枫斗最高(0.08570%)>铁皮石斛胚状体(0.01662%)>铁皮石斛组培苗(0.00734%)。(3)纤维素含量:铁皮枫斗最高(61.39%)>铁皮石斛组培苗(49.22%)>铁皮石斛胚状体(43.73%)。(4)微量元素含量:铁皮石斛胚状体与铁皮石斛组培苗所含的微量元素除Ca、Mg、Sr略低于市售铁皮枫斗外,其他微量元素含量均高于铁皮枫斗,其中铁皮石斛组培苗的含量最高。(5)氨基酸含量:铁皮石斛组培苗(14.61%)与铁皮石斛胚状体(8.62%)的含量远高于铁皮枫斗(2.11%)。3.药效学比较研究:(1)抗疲劳:铁皮石斛组织培养物可明显延长小鼠负重游泳存活时间,缓解大鼠运动后血糖含量降低的问题,缓解运动后全血乳酸含量及血尿素氮含量的增加,减少肝糖元、肌糖元的消耗,达到抗疲劳效果。(2)耐缺氧:铁皮石斛组织培养物能够明显延长小鼠在常压缺氧条件下的存活时间、亚硝酸盐中毒存活时间及急性脑缺血存活时间,且呈现剂量依赖关系,提示其具有一定的抗缺氧作用。(3)抗辐射:铁皮石斛组织培养物可以提高辐射后小鼠外周血白细胞的数量并恢复小鼠脾脏指数、胸腺指数,预防性给药后,小鼠SOD活性高于模型组,MDA含量低于模型组,说明铁皮石斛组织培养物可明显降低辐射对的小鼠损伤。(4)体外抗氧化:铁皮石斛组织培养物水煎液对羟自由基与超氧阴离子自由基有一定的清除作用,并对脂质过氧化产生抑制作用,证明其有一定的抗氧化能力。(5)体外抗肿瘤:铁皮石斛组织培养物的水煎液与精多糖对4种肿瘤细胞(A549、SW480、Hela、QGY)均有一定的抑瘤作用,但与浓度不相关,可以将水煎液浓度20 mg·mL-1和精多糖浓度500μg·mL-1作为最佳抑瘤浓度,证实其可以在临床上用于辅助治疗肺癌、结肠癌、宫颈癌及肝癌。结论:1.本文采用的2种组培铁皮石斛是由上海汤振生物技术有限公司提供的专利产品,是由原生植株成年茎段上诱导休眠芽,由茎尖植入外植体接种至液体培养基与固体培养基上所得(其具体培养条件保密);选择的对照药材铁皮枫斗是由野生铁皮石斛烘干制成,不掺杂其他任何成分,可以作为野生铁皮石斛的代表。本文首次对此专利产品与市售铁皮枫斗进行了品质评价研究。2.本文首次对组培铁皮石斛与市售铁皮枫斗进行了形态学的比较。由于生长条件与生长时间不同,组培品与野生种在宏观特征上有较大差异,但由于来源一致,其气味相同;微观特征上,组培铁皮石斛由于培养时间短,故显微特征较少。3.本文首次较系统的对组培铁皮石斛与市售铁皮枫斗进行了化学成分比较。结果表明,2种组培铁皮石斛药材由于培养时间短,在多糖、生物碱的含量上略低于市售铁皮枫斗,而由于培养基中含有丰富的营养物质,所含的氨基酸与微量元素等营养成分则远高于铁皮枫斗,纤维化程度也不高,证实组培品含有较高的营养成分,可以满足人体的健康需要,由此可见2种组培铁皮石斛药材的化学品质不低于野生种。4.本文首次对组培铁皮石斛进行了多项药效学研究。在抗氧化及抗肿瘤试验中,首次采用铁皮石斛组织培养物的水煎液进行实验。药效学的实验证实组培铁皮石斛在抗疲劳、耐缺氧、抗辐射、抗氧化和抗肿瘤方面均有一定的疗效,可以用于临床治疗或辅助治疗,为组培铁皮石斛的进一步药理活性研究提供了理论依据。5.组培铁皮石斛具有生产周期较短、生产方式简便、生产条件可控、产品质量均一、产量大、价格较低等优点,在现代生活中不仅可以应用于医药行业,还可以在保健食品、美容护肤品等方面发挥作用,这也为解决野生铁皮石斛资源紧缺的难题提供了有效途径。