论文部分内容阅读
恶性肿瘤的发病率在世界范围内逐渐增高,而肿瘤的发生与一些肿瘤相关基因的改变相关,即癌基因与抑癌基因之间的平衡被打破造成的,非正常的生活方式、各种污染、激素变化、辐射、药物及基因等因素也是其诱因。肿瘤坏死因子α诱导蛋白 8(tumor necrosis factor α inducedprotein-8,TNFAIP8)是转录因子NF-κB可诱导的抗凋亡,致癌分子,分子量为21kD的胞浆蛋白。TNFAIP8在肾癌及乳腺癌中高表达,过表达的TNFAIP8可导致乳腺癌、肺癌、肾细胞癌和食管鳞状细胞癌的进展,因其在细胞凋亡信号转导、肿瘤发生、侵袭及转移过程中具有重要调控作用而逐渐成为研究的热点。为了进一步探索TNFAIP8在肿瘤发生和发展中的作用,我们拟构建其原核表达载体TNFAIP8-PET-22b(+),并表达纯化TNFAIP8蛋白。同时应用TNFAIP8蛋白免疫新西兰兔制备其多抗;使用TNFAIP8蛋白免疫BALB/c鼠融合并筛选杂交瘤细胞株、制备其单克隆抗体并鉴定抗体活性。为了深入的探究干扰表达TNFAIP8后对肿瘤细胞的影响及其在肿瘤发生发展中的作用机制,我们设计并合成针对人TNFAIP8基因的RNA干扰序列,将其连接到pSIREN-RetroQ载体,构建TNFAIP8基因的shRNA重组质粒。经脂质体法转染TNFAIP8-shRNA-pSIREN-RetroQ干扰质粒、载体pSIREN-RetroQ质粒和GFP-pSIREN-RetroQ质粒至人肺腺癌细胞系A549细胞,并检测其干扰TNFAIP8表达的效果。荧光显微镜检测带有GFP基因质粒的表达情况以确认转染效率,应用RT-PCR以及Western-Blot方法检测并筛选在mRNA和蛋白水平干扰效率最佳的干扰片段。通过干扰A549细胞TNFAIP8蛋白的表达,确定TNFAIP8对肿瘤细胞生长的影响。研究结果表明,我们成功构建TNFAIP8-PET-22b(+)表达载体,筛选到TNFAIP8高表达菌株,确定最适诱导条件为0.6mMIPTG诱导10h,纯化复性后的TNFAIP8蛋白纯度在90%%以上。Western-Blot结果表明所纯化的蛋白可与抗TNFAIP8抗体发生特异结合。TNFAIP8免疫新西兰兔获得2株多克隆抗体,其效价分别为104和105。检测得出制备的多克隆抗体不可以应用于Western-Blot和免疫组化。TNFAIP8免疫BALB/c鼠后融合筛选出8株杂交瘤细胞株,其分泌的抗体效价分别是104、106、104、105、106、104、104和106,经鉴定1号至5号可应用于Western-Blot。针对TNFAIP8基因的不同片段,我们成功设计和构建了三条干扰质粒TNFAIP8-shRNA-pSIREN-RetroQ。GFP-pSIREN-RetroQ 对照质粒转染 A549 细胞48h后,荧光显微镜下可观察到大量绿色荧光蛋白的表达,其转染效率为80%,经 RT-PCR 和 Western-Blot 证实 TNFAIP8-shRNA1-pSIREN-RetroQ 能有效干扰并显著抑制细胞内TNFAIP8基因的表达。应用终浓度100μg/mL的aDR5ScFv分别作用转染TNFAIP8-shRNA1干扰质粒和空载质粒的A549细胞16h,流式结果显示前者早、晚期凋亡率均有增加,前者凋亡率为36.3%高于后者11.53%,说明TNFAIP8具有抑制肿瘤细胞凋亡的作用。本实验成功获得TNFAIP8-PET-22b(+)原核表达载体,纯化到TNFAIP8蛋白;获得2株TNFAIP8多克隆抗体;筛选的5株单克隆抗体可用于Western-Blot检测;成功获得TNFAIP8-shRNA-pSIREN-RetroQ干扰质粒;通过流式检测发现降低TNFAIP8表达可以提高细胞对aDR5ScFv诱导凋亡的敏感性。