防治脑缺血/再灌注损伤，寻找有效的治疗药物及措施，促进脑卒中后中枢神经系统功能恢复，一直是生命科学研究的重点和热点。研究发现，缺血前给予一定的预处理措施，能有效减轻缺血后的损伤，即缺血耐受(Ischemictolerance)。近年来，已发现众多不同的刺激均能诱导产生脑缺血耐受。我们的以前研究已经证实电针预处理可以诱导大鼠产生脑缺血耐受。新近的研究发现电针预处理可以增加大鼠脑内源性大麻素2-AG和AEA的含量，并上调大麻素CB1受体，且CB1受体拮抗剂能够逆转电针预处理诱导脑缺血耐受，表明电针预处理通过大麻素CB1受体介导脑保护作用。然而CB1受体通过何种细胞内信号通路介导电针预处理诱导脑缺血耐受效应呢？另外，由于预处理需在缺血前实施，而临床上许多缺血/再灌注损伤的发生不可预见，使其临床应用价值受限。2003年Zhao等提出了“缺血后处理(Ischemic Postconditioning)”的概念，即在缺血再灌注早期，进行一次或数次短暂重复的心肌缺血再灌注，能提高心肌对之前发生的较长时间缺血的耐受性。由于缺血后处理比预处理在实施上有更好的可预测性及临床可控性，在缺血再灌注损伤方面开启了一个新的治疗窗口。在此基础上，Andreka等在2007年证实，心脏缺血后给予短暂的肢体缺血，也可以对心脏缺血再灌注损伤起到保护作用，提出“远程后处理(Remote Postconditioning)”的概念。与缺血后处理相比，肢体远程缺血后处理更安全，也更易于实施，更符合临床应用的实际需求。然而，目前关于远程缺血后处理是否对脑有保护作用，有待进一步证实，而且其保护机制也需进一步阐述。蛋白激酶C(PKC)家族拥有10种同工酶，中枢神经细胞和组织中可以检测到PKCα、PKCβ1、PKCβ2、PKCγ、PKCε、PKCδ、PKCη、PKCθ和PKCξmRNA和蛋白质表达。大量的研究已报道不同PKC同工酶参与脑缺血损伤和预处理的脑保护机制并发挥重要的作用，其中PKCε和PKCδ的作用比较明确，目前大多数证据支持缺血前PKCε激活可模拟预处理保护缺血再灌注损伤，而再灌注期间PKCδ激活参与再灌注损伤。因此，本研究拟采用SD大鼠局灶性脑缺血/再灌注（MCAO）模型，研究远程缺血后处理的脑保护作用，并探讨PKCε和PKCδ在电针预处理和远程缺血后处理诱导脑保护中的角色。第一部分：电针预处理通过CB1受体激活εPKC诱导大鼠脑缺血耐受实验一、电针预处理对大鼠脑εPKC活化的影响目的：探讨电针预处理对大鼠脑内εPKC活化的影响。方法：成年雄性SD大鼠随机分为3组，每组各5只动物。Naive组：动物不进行任何处理。Sham组：动物接受与EA组动物相同的麻醉（1%戊巴比妥钠，40 mg/kg，i.p.）和针刺，但不通电刺激。EA组：动物在麻醉下接受30min的电针刺激。动物电针预处理后30min、60min和120min时断头取脑行Western blot分析εPKC活化。结果：电针预处理后30min、60min和120min时，EA组εPKC比率明显高于Sham组（升高44%，P < 0.05），εPKC转位的高峰出现在电针预处理后60min时（升高75%，P < 0.01）。Sham组和Naive组间动物εPKC激活程度差异无统计学意义（P > 0.05）。结论：电针预处理后30min即可观察到脑内εPKC活化增加，可持续到电针预处理后120min，其中预处理后60min时εPKC活化达到顶峰。实验二、εPKPKC活化对脑缺血再灌注损伤的影响目的：探讨特异性εPKC激动剂TAT-ψεRACK对大鼠脑缺血再灌注损伤的影响。方法：成年雄性SD大鼠随机分为3组，每组各10只动物。MCAO组：动物行120min大脑中动脉阻闭（MCAO）后再灌注72h。TAT-ψεRACK +MCAO组：动物MCAO前2 h给予TAT-ψεRACK 0.2mg/kg（溶于1ml生理盐水，i.p.），余同MCAO组。TAT-β-Gal+MCAO组：动物MCAO前2 h给予TAT-β-Gal 0.2mg/kg（溶于1ml生理盐水，i.p.），余同MCAO组。所有动物于再灌注后72 h行神经功能评分和脑梗死容积测定。结果：再灌注后72 h，与MCAO组相比，TAT-ψεRACK+MCAO组动物神经功能评分显著增高，脑梗死容积百分比明显减小（P < 0.01）。MCAO组和TAT-β-Gal+MCAO组间动物神经功能评分和脑梗死容积百分比差异无统计学意义（P > 0.05）。结论：给予εPKC特异性激动剂能够模拟电针预处理的脑保护作用。实验三、TAT-εV1-2对电针预处理诱导的脑保护作用的影响目的：探讨特异性εPKC抑制剂TAT-εV1-2对电针预处理诱导的脑保护作用的影响。方法：成年雄性SD大鼠随机分为5组，每组各10只。所有动物MCAO前3 h给予1%戊巴比妥钠（40mg/kg，i.p.）麻醉。MCAO组：动物行120min大脑中动脉阻闭（MCAO）后再灌注72h。EA+MCAO组：动物MCAO前2 h接受30min电针预处理，余同MCAO组。TAT-εV1-2+EA组：动物电针预处理前30 min给予TAT-εV1-2 0.2mg/kg（溶于1ml生理盐水，i.p.），余同EA+MCAO组。TAT-β-Gal+EA组：动物电针预处理前30 min给予TAT-β-Gal 0.2mg/kg（溶于1ml生理盐水，i.p.），余同EA+MCAO组。TAT-εV1-2+MCAO组：动物MCAO前3 h给予TAT-εV1-2 0.2mg/kg（溶于1ml生理盐水，i.p.），余同MCAO组。所有动物于再灌注后72 h行神经功能评分和脑梗死容积测定。结果：再灌注后72 h，与MCAO组相比，EA+MCAO组和TAT-β-Gal+EA组动物神经功能评分明显增高，脑梗死容积百分比明显减小（P < 0.01），EA+MCAO组和TAT-β-Gal+EA组两组间比较差异无统计学意义（P > 0.05）。TAT-εV1-2+EA组动物神经功能评分高于MCAO组（P <0.05）但小于EA+MCAO组（P < 0.01）；TAT-εV1-2+EA组动物脑梗死容积百分比小于MCAO组（P < 0.05）但大于EA+MCAO组（P < 0.01）。TAT-εV1-2+MCAO组和MCAO组间动物神经功能评分和脑梗死容积百分比差异无统计学意义（P > 0.05）。结论：电针预处理前给予εPKC特异性抑制剂可部分逆转电针预处理对局灶性脑缺血/再灌注损伤的保护作用。实验四、εPKPKC活化对脑缺血再灌注后神经元凋亡的影响目的：探讨εPKC活化对脑缺血再灌注后神经元凋亡的影响。方法：成年雄性SD大鼠随机分为5组，每组各5只动物。所有动物MCAO前3 h给予1%戊巴比妥钠（40mg/kg，i.p.）麻醉。Control组：接受除缺血外与MCAO组相同的处理，为MCAO组的对照。MCAO组：动物行120min大脑中动脉阻闭（MCAO）后再灌注24h。EA+MCAO组：动物MCAO前2 h接受30min电针预处理，余同MCAO组。TAT-εV1-2+EA组：动物电针预处理前30 min给予TAT-εV1-2 0.2mg/kg（溶于1ml生理盐水，i.p.），余同EA+MCAO组。TAT-ψεRACK+MCAO组：动物MCAO前3 h给予TAT-ψεRACK 0.2mg/kg（溶于1ml生理盐水，i.p.），余同MCAO组。所有动物于再灌注后24 h行TUNEL染色和Western blot分析Bcl-2和Bax表达。结果：再灌注后24 h，Control组动物脑片中TUNEL染色为阴性，MCAO组和TAT-εV1-2+EA组动物脑缺血半影区显示大量TUNEL阳性细胞，而EA+MCAO组和TATψεRACK+MCAO组动物脑缺血半影区仅显示少量TUNEL阳性细胞。与MCAO组相比，EA+MCAO组和TAT-ψεRACK+MCAO组动物脑缺血半影区TUNEL阳性神经元计数明显减少（P < 0.01）。与EA+MCAO组相比，TAT-εV1-2+EA组动物脑缺血半影区TUNEL阳性神经元计数明显增多（P <0.01）。TAT-εV1-2+EA组和MCAO组间动物神经功能评分差异无统计学意义（P＞0.05）。缺血/再灌注损伤可使脑缺血半影区Bcl-2和Bax含量显著增高(P < 0.01，MCAO vs Control)。与MCAO组相比，EA和TAT-ψεRACK预处理能够进一步增高Bcl-2含量，降低Bcl-2含量(P < 0.01，MCAO)。然而在预处理前给予TAT-εV1-2可抑制电针预处理所致的Bcl-2含量增高和Bax含量降低(P < 0.05, TAT–εV1-2+EA vs EA+MCAO)。结论：εPKC活化可上调脑缺血半影区Bcl-2表达、抑制Bax表达，减少神经元凋亡。实验五、大麻素受体拮抗剂对电针预处理脑保护作用的影响目的：探讨大麻素CB1受体拮抗剂AM251和CB1受体拮抗剂AM630对电针预处理脑保护作用的影响。方法：成年雄性SD大鼠随机分为7组，每组各10只动物。MCAO组：动物行120min大脑中动脉阻闭（MCAO）后再灌注72 h。EA+MCAO组：动物MCAO前2 h接受30min电针预处理，余同MCAO组。AM251+EA组：动物在电针预处理前30min给予CBR1拮抗剂AM251 1mg/kg（i.p.），余同EA+MCAO组。AM251+MCAO组：动物在MCAO前3 h给予CBR1拮抗剂AM251 1mg/kg（i.p.），余同MCAO组。AM630+EA组：动物在电针预处理前30min给予CBR2拮抗剂AM630 1mg/kg（i.p.），余同EA+MCAO组。AM630+MCAO组：动物在MCAO前3 h给予CBR2拮抗剂AM630 1mg/kg（i.p.），余同MCAO组。Vehicle+EA组：动物在电针预处理前30min给予溶剂3ml/kg（i.p.），余同EA+MCAO组。所有动物于再灌注后72 h行神经功能评分和脑梗死容积测定。结果：再灌注后72h，与MCAO组相比，EA+MCAO组动物神经功能评分明显增高，脑梗死容积百分比明显减小（P < 0.05）。电针预处理前给予AM251逆转了电针预处理的脑保护作用（P < 0.05，AM251+EA vs EA+MCAO）。而电针预处理前给予AM630和溶剂（Vehicle）均不影响电针预处理的保护效果（P > 0.05，AM630+EA vs EA+MCAO，Vehicle+EA vs EA+MCAO）。AM251和AM630本身对MCAO所致的神经功能损伤没有影响(P > 0.05，AM251+MCAO vsMCAO，AM630+MCAO vs MCAO)。结论：给予CBR1拮抗剂能够逆转电针预处理的神经保护作用，而CBR2拮抗剂对电针预处理的脑保护作用没有影响。实验六、大麻素受体拮抗剂对电针预处理后εPKPKC活化的影响目的：探讨大麻素CB1受体拮抗剂AM251和CB1受体拮抗剂AM630对电针预处理后εPKC活化的影响。方法：成年雄性SD大鼠随机分为6组，每组各5只动物。Sham组：动物接受与EA组动物相同的麻醉（1%戊巴比妥钠，40 mg/kg，i.p.）和针刺，但不通电刺激。EA组：动物在麻醉下接受30min的电针刺激。AM251+EA组：动物在电针预处理前30min给予CBR1拮抗剂AM251 1mg/kg（i.p.），余同EA组。AM630+EA组：动物在电针预处理前30min给予CBR2拮抗剂AM630 1mg/kg（i.p.），余同EA组。AM251组：动物接受与AM251+EA组相同的处理但不通电刺激。AM630组：动物接受与AM630+EA组相同的处理但不通电刺激。所有动物于再灌注后24 h行TUNEL染色和Western blot分析Bcl-2和Bax表达。结果：电针预处理后60min时，Sham组、AM251组和AM630组动物脑εPKC转位没有统计学差异（P >0.05）。EA组和AM630+EA组膜绑定εPKC比率明显高于Sham组（P < 0.01），电针预处理前给予AM251能够明显抑制电针预处理诱导的εPKC转位（P <0.05，AM251+EA vs EA）。但是单独给予AM251对εPKC活化没有影响（P >0.05，AM251 vs Sham）。结论：电针预处理前给予CB1受体拮抗剂可逆转电针预处理激活脑εPKC的作用。第二部分：远程缺血后处理抑制δPKC激活减轻脑缺血再灌注损伤实验一、远程缺血后处理对脑缺血再灌注损伤的影响目的：探讨远程缺血后处理对脑缺血再灌注损伤的影响。方法：成年雄性SD大鼠随机分为3组，每组各10只动物。Control组动物行120min大脑中动脉阻闭（MCAO）后再灌注72h。RPostC组动物接受MCAO120min，再灌注时在1%戊巴比妥钠（40 mg/kg，i.p.）麻醉下接受远程缺血后处理。SP组动物接受MCAO120min，再灌注时只接受1%戊巴比妥钠（40 mg/kg，i.p.）麻醉。所有动物于再灌注后72 h行神经功能评分和脑梗死容积测定。结果：再灌注后72 h。与Control组相比，RPostC组动物神经功能评分显著增高，脑梗死容积百分比明显减小（P < 0.01）。Control组和SP组间动物神经功能评分差异无统计学意义(P > 0.05)。结论：远程缺血后处理能够减少局灶性脑缺血/再灌注损伤后脑梗死容积，改善神经功能评分，对缺血性脑损伤具有神经保护作用。实验二、远程缺血后处理对脑缺血再灌注后神经元凋亡和δPKC活化的影响目的：探讨远程缺血后处理对脑缺血再灌注后神经元凋亡和δPKC活化的影响。方法：成年雄性SD大鼠随机分为4组，每组各5只动物。Naive组动物接受同样的麻醉和手术准备，但不行缺血/再灌注损伤。Control组动物行120min大脑中动脉阻闭（MCAO）后再灌注24h。RPostC组动物接受MCAO120min，再灌注时在1%戊巴比妥钠（40 mg/kg，i.p.）麻醉下接受远程缺血后处理。SP组动物接受MCAO120min，再灌注时只接受1%戊巴比妥钠（40 mg/kg，i.p.）麻醉。所有动物于再灌注后24 h行TUNEL染色和Westernblot分析δPKC活化。结果：再灌注后24 h。Control和SP组动物脑缺血半影区显示大量TUNEL阳性细胞，而RPostC组动物脑缺血半影区仅显示少量TUNEL阳性细胞，与Control组相比，RPostC组TUNEL阳性神经元计数明显减少（P < 0.01），δPKC活化程度明显降低（P < 0.05）。Control组和SP组间动物缺血半影区TUNEL阳性神经元计数和δPKC活化差异无统计学意义（P> 0.05）。结论：远程缺血后处理能够抑制局灶性脑脑缺血/再灌注损伤后缺血半影区δPKC活化和神经元凋亡。实验三、TATTAT-δV1-1对脑缺血再灌注损伤的影响目的：探讨特异性δPKC抑制剂TAT-δV1-2对脑缺血再灌注损伤的影响。方法：成年雄性SD大鼠随机分为3组，每组各10只动物。Control组动物行120min MCAO后再灌注72 h。TAT-δV1-1组动物接受MCAO120min，再灌注时给予δPKC选择性抑制剂TAT-δV1-1（0.2 mg/kg，i.p.溶于1ml生理盐水）。TAT-β-Gal组动物接受MCAO120min，再灌注时给予无生物学活性的蛋白TAT-β-Gal作为对照（0.2 mg/kg，i.p.溶于1ml生理盐水）。所有动物于再灌注后72 h行神经功能评分和脑梗死容积测定。结果：再灌注后72 h。与Control组相比，TAT-δV1-1组动物神经功能评分显著增高，脑梗死容积百分比明显减小（P < 0.01）。Control组和TAT-β-Gal组间动物神经功能评分差异无统计学意义(P > 0.05)。结论：再灌注时给予δPKC特异性抑制剂能够模拟远程缺血后处理的神经保护效果。小结1.电针预处理可激活早期大鼠脑内εPKC，给予εPKC特异性活化剂能够模拟电针预处理的脑保护作用，而电针预处理前给予εPKC特异性抑制剂可部分逆转电针预处理对局灶性脑缺血再灌注损伤的保护作用；电针预处理和εPKC特异性活化剂均可上调脑缺血后Bcl-2表达、抑制Bax表达，减少缺血半影区神经元凋亡，而εPKC特异性抑制剂则可抑制电针预处理减少凋亡的有益作用；而且给予CB1受体拮抗剂能够逆转电针预处理的神经保护作用和增加脑εPKC活化的作用，而CB2受体拮抗剂无此效应，表明电针预处理通过CB1受体，激活εPKC，上调脑缺血后Bcl-2表达、抑制Bax表达，减少缺血半影区神经元凋亡，起到神经损伤保护的作用。2.远程缺血后处理能够减少局灶性脑缺血/再灌注损伤后脑梗死容积，改善神经功能评分，减少缺血半影区神经元凋亡和抑制缺血半影区δPKC活化，而且再灌注是给予δPKC特异性抑制剂，能够模拟远程缺血后处理的神经保护效果，表明远程缺血后处理是通过或至少部分通过抑制δPKC活化抑制神经元凋亡的途径对缺血性脑损伤起神经保护作用的。