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研究背景骨缺损通常由外伤、肿瘤切除等引起,在骨科中较为常见,其治疗方法通常包括自体骨、异体骨移植及生物材料替代等,它们为骨组织提供了机械支撑,填补了缺损的骨组织,并为新骨的生成搭建了桥梁。自体及异体骨虽然在促进骨缺损的修复方面具有较大的优势,但是其来源有限、且会增加疾病传播的风险。这也就凸显了生物材料在应用中的优势,同时促进了生物材料的开发与应用,其中Ti6Al4V合金材料,是应用较为广泛的医用钛合金材料,它具有良好的机械及抗腐蚀性能,然而它的生物活性较差,在成骨性能上表现一般,这也就导致Ti6Al4V合金材料植入后与骨的结合不够牢固,容易发生植入物松动,失败率较高。铜(Cu)作为体内一种必须微量元素,对于许多代谢反应是必不可少的,并且,它对骨的发育及血管的生成具有重要作用。于是,近年来,关于铜在Ti6Al4V合金改性中的研究越来越多,研究多集中在含铜涂层的制备及含铜钛合金的铸造,但涂层存在结合度不够,容易脱落等问题,而铸造有需模具,制备太过繁琐,且不能根据临床需求实现个性化定制,限制了材料的进一步应用,近年来3D打印技术的发展,为这些问题的解决提供了突破口,3D打印技术不仅可以实现其将铜元素整合进Ti6Al4V合金材料中,还能实现个性化、精确化制备,且目前关于3D打印的方式将铜与Ti6Al4V合金整合的研究较为少见,因此本研究决定使用3D打印的方式制造Ti6Al4V-4Cu合金材料,考虑到选择性激光熔融(SLM)技术在金属3D打印中的优势,我们决定使用SLM技术进行制备。因此本课题将通过SLM技术制备3D打印的Ti6Al4V材料(对照组),3D打印的Ti6Al4V-4Cu合金材料(实验组),并对其生物相容性及成骨性能进行评价,以期望为骨植入材料的开发提供一种新的策略。方法1.3D打印Ti6Al4V-4Cu合金材料的制备及生物相容性评价1.1通过选择性激光熔融(SLM)技术制备Ti6Al4V-4Cu合金材料,并通过电镜及X射线能谱分析对Ti6Al4V-4Cu合金材料进行表征,同时打印Ti6Al4V合金材料,作为本研究的对照组;1.2制备Ti6Al4V-4Cu合金材料浸提液,通过CCK8实验检测其对小鼠BMSCs及小鼠RAW264.7细胞增殖的影响;1.3通过CCK8实验及流式细胞分析,检测Ti6Al4V-4Cu合金材料对小鼠BMSCs及人EA.hy926细胞增殖和凋亡的影响;1.4通过共聚焦显微镜检测Ti6Al4V-4Cu合金材料上小鼠BMSCs的粘附情况,通过划痕实验检测Ti6Al4V-4Cu合金材料浸提液对小鼠BMSCs迁移的影响。2.3D打印Ti6Al4V-4Cu合金材料对骨免疫调节的研究2.1通过RT-PCR实验检测Ti6Al4V-4Cu合金材料浸提液对小鼠BMSCs成骨相关基因ALPL、COL-1、Runx-2、OPN、OPG表达的影响;2.2通过RT-PCR实验检测Ti6Al4V-4Cu合金材料浸提液对小鼠RAW264.7细胞炎症相关基因i NOS、IL-4相关基因的影响;2.3通过ELISA实验检测Ti6Al4V-4Cu合金材料浸提液对小鼠RAW264.7细胞分泌的BMP-2及VEGF-a因子的影响;2.4利用Ti6Al4V-4Cu合金材料浸提液与小鼠RAW264.7细胞培养后的上清液制备成骨条件培养基,与小鼠BMSCs共培养,然后通过RT-PCR实验检测成骨相关基因ALPL、COL-1、Runx-2、OPN、OPG的表达情况。3.3D打印Ti6Al4V-4Cu合金材料对成骨及成血管的影响及其机制研究3.1通过RT-PCR实验检测Ti6Al4V-4Cu合金材料对小鼠BMSCs成骨相关基因ALPL、COL-1、Runx-2、OCN、OPN、OPG表达的影响;3.2通过WB实验检测Ti6Al4V-4Cu合金材料对小鼠BMSCs成骨相关蛋白COL-1、BSPII、OPG、OCN表达的影响,同时用试剂盒检测ALPL的表达量;3.3通过免疫荧光检测Ti6Al4V-4Cu合金表面小鼠BMSCs细胞中COL-1的表达情况;3.4通过茜素红染色检测Ti6Al4V-4Cu合金材料对骨矿化的影响;3.5通过RT-PCR实验检测Ti6Al4V-4Cu合金材料对人EA.hy926细胞成血管相关基因Ang-1、CD31、v WF、VEGF-a、VEGF-R2表达的影响;3.6通过WB实验检测Ti6Al4V-4Cu合金材料对人EA.hy926细胞成血管相关蛋白v WF、Ang-1、CD31表达的影响;3.7通过免疫荧光检测Ti6Al4V-4Cu合金表面人EA.hy926细胞VEGF-R2的表达情况;3.8通过WB实验检测Ti6Al4V-4Cu合金材料表面小鼠BMSCs及人EA.hy926细胞中HIF-1α/VEGF-a通路的表达情况。4.3D打印Ti6Al4V-4Cu合金材料对骨整合影响的体内实验研究4.1通过SLM技术制备3D打印的Ti6Al4V-4Cu合金多孔支架材料,以用于动物实验;4.2制备兔子股骨髁骨缺损模型,植入Ti6Al4V-4Cu合金多孔支架材料,用于帮助骨缺损的修复;4.3通过Micro CT检测Ti6Al4V-4Cu合金多孔支架材料内骨长入的深度及BV/TV进行分析。结果1.3D打印Ti6Al4V-4Cu合金材料的制备及生物相容性评价1.1 3D打印的Ti6Al4V-4Cu合金材料制备成功,其是以银灰色β相为基体,与深灰色针状α相交叉排列组成,铜元素的质量百分比为4.08%±0.83%;1.2 Ti6Al4V-4Cu合金材料浸提液在对小鼠BMSCs及小鼠RAW264.7细胞的增殖检测中显示了较低的毒性;1.3 Ti6Al4V-4Cu合金材料在对小鼠BMSCs及人EA.hy926细胞的增殖和凋亡的检测中,显示出来较好的生物相容性;1.4 Ti6Al4V-4Cu合金材料不影响小鼠BMSCs的粘附及细胞铺展,并对小鼠BMSCs的迁移具有良好的促进作用。2.3D打印Ti6Al4V-4Cu合金材料对骨免疫调节的研究2.1 Ti6Al4V-4Cu合金材料浸提液可促进小鼠BMSCs成骨相关基因OPG的表达增加,但对ALPL、COL-1、Runx-2、OCN、OPN的表达未显示出明显的促进作用;2.2 Ti6Al4V-4Cu合金材料浸提液可以抑制小鼠RAW264.7细胞促炎基因i NOS的表达,同时促进抑炎基因IL-4的表达;2.3 Ti6Al4V-4Cu合金材料浸提液可以促进小鼠RAW264.7细胞分泌BMP-2及VEGF-a因子;2.4 Ti6Al4V-4Cu合金材料浸提液与小鼠RAW264.7培养后的上清液制备的成骨条件培养基显著促进了小鼠BMSCs成骨相关基因ALPL、COL-1、Runx-2、OCN、OPN、OPG的表达,造成这一原因的结果,我们推测可能是因为Ti6Al4V-4Cu合金材料析出的铜离子降低了小鼠RAW264.7的炎性,并促进其分泌了更多的BMP-2及VEGF-a因子,进而促进成骨基因的表达。2.5 Ti6Al4V-4Cu合金材料提升了Ti6Al4V合金材料的骨免疫调节能力3.3D打印Ti6Al4V-4Cu合金材料对成骨及成血管的影响及其机制研究3.1 Ti6Al4V-4Cu合金材料可以促进小鼠BMSCs成骨相关基因ALPL、COL-1、Runx-2、OCN、OPG的表达;3.2 WB结果显示Ti6Al4V-4Cu合金材料可以诱导小鼠BMSCs中COL-1、BSPII、OPG、OCN成骨蛋白的表达,同时ALPL检测试剂盒也提示在Ti6Al4V-4Cu合金材料组中有更高的表达量;3.3免疫荧光结果提示Ti6Al4V-4Cu合金表面的小鼠BMSCs的COL-1表达更高;3.4茜素红染色提示Ti6Al4V-4Cu合金材料更加有利于小鼠BMSCs的成骨矿化;3.5 Ti6Al4V-4Cu合金材料可以促进人EA.hy926细胞成血管相关基因Ang-1、CD31、v WF、VEGF-a、VEGF-R2的表达;3.6 WB结果提示Ti6Al4V-4Cu合金材料可以诱导人EA.hy926细胞中v WF、Ang-1、CD31成血管相关蛋白的表达;3.7免疫荧光结果提示Ti6Al4V-4Cu合金表面人EA.hy926细胞可以表达更多的VEGF-R2蛋白;3.8 WB结果提示,Ti6Al4V-4Cu合金材料表面的小鼠BMSCs细胞可以表达更多的HIF-1α、VEGF-a及COL-1蛋白,其表面的人EA.hy926细胞也可以表达更多的HIF-1α、VEGF-a及VEGF-R2蛋白,因此我们推测,Ti6Al4V-4Cu合金材料对成骨和成血管的促进作用,可能是通过HIF-1α/VEGF-a通路发生的。3.9 Ti6Al4V-4Cu合金材料提升了Ti6Al4V合金材料的成骨及成血管能力,具有更广阔的应用前景。4.3D打印Ti6Al4V-4Cu合金材料对骨整合影响的体内实验研究4.1成功制备Ti6Al4V-4Cu合金多孔支架材料,CT结果支架材料孔隙均匀且互相联通;4.2成功制备了兔子股骨髁骨缺损模型,植入Ti6Al4V-4Cu合金多孔支架材料的实验顺利,无感染的情况发生;4.3通过Micro CT检测发现,相比于Ti6Al4V合金材料,Ti6Al4V-4Cu合金材料虽不能增加骨长入的深度,但在骨长入的体积分数BV/TV上更胜一筹,拥有更好的骨整合性能。小结1.成功制备了3D打印的Ti6Al4V-4Cu合金材料,且相比于3D打印的Ti6Al4V合金材料,其依然拥有较好的生物相容性;2.3D打印的Ti6Al4V-4Cu合金材料可以通过调节巨噬细胞的免疫反应,促进成骨基因的表达;3.3D打印的Ti6Al4V-4Cu合金材料可以促进小鼠BMSCs向成骨方向分化;4.3D打印的Ti6Al4V-4Cu合金材料可以促进人EA.hy926细胞成血管分化;5.3D打印的Ti6Al4V-4Cu合金材料对成骨和成血管的促进作用,可能是通过激活HIF-1α/VEGF-a通路发生的;6.3D打印的Ti6Al4V-4Cu合金材料在动物体内显示出了优异的成骨性能;7.总之,本研究创造性将铜元素引入Ti6Al4V合金材料中,制备了3D打印的Ti6Al4V-4Cu合金材料,并就其成骨性能做了深入探讨,证明了相比于Ti6Al4V合金,Ti6Al4V-4Cu合金材料拥有更加优异的成骨性能,为骨科植入材料的研究与开发提供了一种新的策略。。