淫羊藿为中国传统中草药之一，具有2000多年的悠久历史。它不仅具有补肾阳、强筋骨、祛风湿等功效，而且还兼有抗衰老、改善免疫功能、抑制肿瘤和抗骨质疏松等功效。另外，淫羊藿属植物因其丰富多彩的花色和叶色以及奇特的花型和叶型亦被当作地被植物和观赏植物使用。过去对淫羊藿属植物的研究主要集中在植物种类及分布、形态分类、类黄酮物质提取分离及鉴定、药理药效研究、资源收集与质量评价等方面，而在分子生物学、遗传学和基因组学方面的研究相对较少。淫羊藿药用植物中有效活性成分主要为黄酮醇苷类物质，含有特殊的异戊烯基结构，为类黄酮合成途径的一重要分支的末端产物，其分子合成机制目前知之甚少。因此，淫羊藿类黄酮合成途径中重要基因的挖掘不仅有利于有效活性成分合成机制的阐明，还有利于花色和叶色丰富多彩背后的花青素苷合成累积模式的了解，并且还可以为药用植物代谢工程的顺利开展提供理论基础。重要的是，淫羊藿药用植物中有效活性成分的含量在不同物种、不同居群、不同环境、甚至在不同发育时期内都表现出显著的差异，这意味着可能存在某些调控因子在控制有效活性成分的合成。另外，由于日益巨大的市场需求和商业价值导致过渡采收，使得淫羊藿野生资源遭到严重破坏甚至濒临灭绝。在此，从分子水平上深入开展淫羊藿类黄酮合成及调控分子机制的研究，结合新品种的培育和对现有多样性资源评估和保护有利于淫羊藿属药用植物资源的可持续利用。本研究中取得的主要结果如下：　　1.类黄酮合成代谢结构基因的分离与分析。利用同源克隆方法，EST database搜索比对，结合RACE技术成功获得了箭叶淫羊藿中类黄酮合成途径中相关基因的全长cDNA克隆，包括Es4CLs，EsC4H，EsF3’H，EsF3’5’H，EsFNSⅡ，EsHPTs，EsACT1，EsC3H，EsCAOMT1，EsIFRL1，EsIFRL2和EsLAR等，其中前6个基因来自于同源克隆方法，后6者则来自于EST database，并且Es4CLs和EsHPTs各获得了三个拷贝。利用生物信息相关数据库和软件，对这些获得的基因进行了序列分析，同源比对及亲缘关系的分析，发现它们都具有各自家族或亚家族的保守特征结构域，并且绝大部基因与葡萄的同源基因最匹配，亲缘关系也较近。同时，利用qPCR实验分析了这些基因在不同组织中的表达模式，除了EsLAR为特异组织表达，其余基因都呈现组成型表达。通过半定量RT－PCR实验发现这些获得的基因中除EsC3H，Es4CL3，EsC4H，EsHPT2和EsHPT3外，其余都在红叶中的表达量高于绿叶中的表达量。最后，对8个代谢途径中重要结构基因的启动子序列进行了分离和顺式调控元件的预测，结果表明除了常规的光、温度、激素等响应元件外，还存在大量的不同形式的MYB结合位点。　　2.类黄酮合成代谢调控基因的分离与功能分析。利用同源克隆和RACE技术成功获得了3个bHLH转录因子和一个R2R3-MYB转录因子的全长cDNA克隆。3个EsbHLH转录因子均具有bHLH DNA-binding domain，并且EsbHLH1和EsbHLH2还具有MYB互作区域(MIR)和激活区域(AD)。从亲缘关系上分析，EsbHLH1属于矮牵牛Jaf13亚组，EsbHLH2属于矮牵牛An1亚组，bHLH3则归属于拟南芥MYC2亚组。qPCR结果表明它们三者分别在花、果实和根组织中的表达量最大。另外，对获得的一个调控花青素苷合成的EsMYBA1转录因子进行了分子特征分析和功能验证。EsMYBA1基因含有3个外显子和2个内含子，ORF长为714 bp，编码237个氨基酸。通过全长cDNA和gDNA克隆的多次测序发现EsMYBA1基因在基因组中可能有两个杂合等位基因或者两个旁系同源基因。另外，还发现了EsMYBA1存在可变剪切模式，它具有分别保留第一个和第二个内含子的转录本。qPCR实验表明EsMYBA1主要在富含花青素苷的组织中表达。在亲缘关系分析上，EsMYBA1与其它调控花青素苷/类黄酮合成途径的MYB调控因子聚为一类。亚细胞定位实验也证实了EsMYBA1位于细胞核内表达，符合转录因子的定位特征。酵母双杂交实验室也证实了EsMYBA1可以与其他调控类黄酮合成途径的bHLH转录因子互作，并且具有自激活能力。在超量表达EsMYBA1的T0转基因烟草中，其生殖器官和营养器官中花青素苷含量显著提升，并且对于表型变化强烈的转基因烟草，其整个植株表现为暗红色。qPCR实验发现EsMYBA1的表达激活了烟草叶片和花组织中DFR和ANS及An1a/b的剧烈上升表达，而FLS表达略下降。最后，在对EsMYBA1基因的启动子序列进行分离时得到了两条不同的启动子序列，但是预测的顺式调控元件在两者中差别不大。　　3.类黄酮途径相关基因与花青素苷及四种有效活性成分合成的相关性分析。结合本实验室前人的研究成果，目前已经获得了箭叶淫羊藿类黄酮合成途径中的大部分相关结构基因以及几个潜在的调控类黄酮合成的转录因子。活性成分分析表明在箭叶淫羊藿叶片中四种成分(淫羊藿苷和朝藿定A、B、C)的含量在叶片发育早期先升高然后逐渐降低，并且在高含量的居群(HN3)和低含量的居群(JX3)中下降程度明显不一。通过对这些基因在淫羊藿不同发育时期叶片内的表达模式分析，以及有效活性成分及花青素苷合成累积模式的分析，找到了与合成代谢具有正相关或者负相关关系的候选基因。在两个居群中与四种活性成分的总量累积模式具有很好的负相关性关系的基因有EsCHI2，具有正相关关系的基因有EsC3OMT，EsUF3GT，EsbHLH4和EsMYBA1。有的基因仅在两个居群中的一个中与四种成分变化有相关性，特别是一些转录因子和后期修饰基因，如在HN3居群中正相关的基因EsbHLH1，EsWDR和EsHPT3，负相关的有EsMYB1，EsMYB12和EsGST；而在JX3居群中正相关的基因有EsbHLH4，EsTTG1，EsCAOMT1和EsC3OMT，负相关性的有Es4CL2，EsCHI2，EsCHS3。叶片活性成分含量测定结果表明叶片发育过程中总花青素苷合成与四种有效活性成分合成之间具有非常匹配的相关性，即花青素苷含量高的组织中四种成分含量也高。通过qPCR实验分析类黄酮途径中相关基因在这些样本中的表达模式，最后发现EsCAOMT1，EsUF3GT，EsMYBA1和EsWDR与花青素苷和四种有效活性成分的变化具有很好的正相关性，而EsCHS3和EsRT却表现出极好的负相关性，同时还发现存在一些相关性程度较弱的基因。