对氧磷酶(Paraoxonase，PON)是一类广谱的非专一性的酶，可以水解磷酸酯、芳香酯及内酯等一系列底物，最初因其能够水解对氧磷(Paraoxon)而得名。最近的研究证明PONs本质上是一种与HDL相关的内酯酶，受apoA—I的强烈刺激。其水解底物的种类和活性有些是相同的，有些却截然不同。PON家族至少有三个成员：PON1、PON2和PON3，人类PON1、PON2和PON3基因位于7号染色体长臂7q21.3-22.1上。PON1和PON3主要由人、鼠等哺乳动物的肝脏产生，PON2则广泛表达于机体各种组织。早期着重于它们能够水解有机磷毒物的特性，但最近二十年的研究发现，PONs可以水解脂质过氧化物、破坏氧化型低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein，Ox—LDL)中的氧化磷脂、阻止低密度脂蛋白(low density lipoprotein，LDL)和高密度脂蛋白(high density lipoprotein，HDL)被氧化修饰，在防治动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)的发生和发展方面起重要作用，有望成为AS基因治疗的新的靶标。 人PON1基因有9个外显子和8个内含子，cDNA全长1065 bp，编码一个含354个氧基酸的蛋白质，分子量为43-45 kDa，等电点(pI)为5.1。人PON1基因在第192位和第55位氨基酸编码区具有多态性，其中以Q/R192多态性更常见，与人类健康关系更密切。Q型PON1水解沙林、梭曼等有机磷毒剂的活性明显高于R型；保护LDL免受氧化修饰、降低体内OX—LDL水平、保护心血管活性也高于R型；而且PON1R型比PON1Q型更容易被氧化修饰的LDL灭活。所以，我们以Q型PON1为靶基因，构建了重组转移载体pVL1392-rhPON1Q。将pVL1392-rhPON1Q和野生型BmNPV病毒DNA一起共转染家蚕BmN细胞，利用同源重组方法构建重组病毒BmNPV—rhPON1Q，经过4轮有限稀释筛选，获得纯系重组病毒并在BmN细胞及家蚕幼虫中进行了高效表达。结果表明，有1/3的rhPON1Q分泌到细胞外，而2/3的rhPON1Q仍留存于胞内。家蚕血淋巴中的rhPON1Q表达水平是1256 mg/L，细胞中的表达水平是24.8mg/L，前者约为后者的50倍。经过DEAE—sepharose离子交换柱和HiTrap chelating HP亲和柱两步纯化，rhPON1Q纯度可达90％。SDS—PAGE and Western blotting显示纯化的rhPON1Q是分子量为40和43 kDa的两条带，其酶学性质与血清来源的PON1一致。非离子去污剂(如NP—40)和钙离子为维持rhPON1Q活性所必需，在二者同时存在的条件下，rhPON1Q纯品可以保持良好的活性。 基因工程蛋白质药物有其自身优点，但在体内应用时存在免疫排斥、半衰期短、容易被降解的不足，我们又尝试将PON1基因直接导入哺乳动物细胞及体内进行表达以评估其应用前景。 基因治疗一般是指将特定的遗传物质转入患者体内，纠正其自身基因结构或功能上的不足，阻止病变的进展，从而达到治病目的的治疗方法。基因治疗将基因直接导入人体细胞进行表达，不需要对表达产物进行分离纯化，易于大规模生产，方便快捷、成本低廉，且不受蛋白质不能有效地进入细胞的限制，因而比基因工程蛋白质药物治疗更具有潜力。 我们将Q型PON1基因插入真核转移载体pcDNA3中，构建了pcDNA3-rhPON1Q重组质粒。利用lipofectamineTM 2000、SuperFect及电脉冲刺激等转染方法使其在多种哺乳动物细胞中进行表达，研究其在不同组织来源的细胞中的表达水平，推测pcDNA3-rhPON1Q在体内不同组织的摄取和表达情况。在此基础上，我们将裸pcDNA3-rhPON1Q质粒通过骨骼肌注射再施加电脉冲的方法或直接尾静脉注射的方法导入小鼠体内，研究其在体内的表达情况。为进一步研究PON1Q作为基因药物防治动脉粥样硬化进行了初步的方法学探索。