引言1996年,本课题组发现了一种发生于面部皮肤外伤愈合后的肉芽肿性疾病,患者晚期均累及脑组织。该病患者主要表现为面部轻重不一的外伤,愈合后出现进行性增大的暗红色斑块,后期脑组织受累,主要表现为脑炎,患者全部在1-4年死亡。根据患者均有外伤史、病理示肉芽肿性炎症、电镜下发现细菌,患者全部死亡等特点,将此疾病命名为:外伤后细菌性致死性肉芽肿(fatal bacterial granuloma after trauma, FBGT)。经过十余年对该疾病发病机制的探索,初步取得了以下进展:1,使用改良培养基在患者皮损组织中成功分离培养出痤疮丙酸杆菌(propionibacterium acnes, P. acnes),使用聚合酶链式反应(PCR),在皮损及病变脑组织中成功扩增出P. acnes的16S rRNA全序列,由此明确P.acnes为新疾病FBGT的病原菌,明确了患者的死亡原因为P. acnes所致的脑感染。2,依据FBGT的临床特点,在大量阅读文献的基础上,提出IAM基因多态性引起相应分子功能的缺陷是FBGT发病机制的假说,并在一例患者中证实了该假说。3,通过分型鉴定,明确FBGT和寻常痤疮的病原菌P. acnes绝大部分属于致病力相对较低的IA亚型。4,在研究P. acnes生物膜(biofilm, BF)形成的过程中发现P. acnes形成BF后耐药性显著升高,解释了FBGT治疗过程中药敏试验结果和临床疗效不符合的现象,并进一步研究了P. acnes在体内形成BF的机制。然而,患者脑脊液及病变处脑组织的细菌分离培养一直未能成功,而免疫组化方法未能明确脑内是否确实存在细菌,PCR方法成功扩增P. acnes 16S rRNA的研究结果虽具有一定说服力,但仍难以给出令人信服的脑感染依据,脑内细菌感染的直接证据成了对该课题进行深入研究的瓶颈。目的通过分子生物学方法,证明FBGT的脑感染病原体与皮损相同;通过分子生物学结合形态学的方法,对FBGT患者的脑损害组织进行病原菌细胞定位,确认FBGT患者的脑感染系继发于面部皮损的痤疮丙酸杆菌感染。方法1.运用Oligo6.0软件和在线工具Primer- BLAST针对P.acnes的16S rRNA和脂肪酶(Lipase)编码序列设计合成两套用于巢氏聚合酶链式反应(nested polymerase chain reaction, nPCR)的特异性引物,优化nPCR反应体系及条件,以FBGT患者皮损处DNA和病变脑组织处DNA为模板,扩增P.acnes的16S rRNA及Lipase编码序列。2.使用nPCR实验中扩增P.acnes16S rRNA的第二对引物扩增标准菌株,以该目的片段为模板,制备地高辛标记的cRNA探针,通过原位杂交(in situ hybridization, ISH)和荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization, FISH)的方法将病原菌mRNA定位于患者的病变脑组织内。结果1.扩增9份FBGT患者的皮损及病变脑组织中的病原菌序列后发现:在16S rRNA (PAS)引物组中,使用第一对引物扩增后,除阳性对照外,患者样本中无明确条带出现;将产物1:1000稀释后使用第二对引物进行扩增,其中7份样本中出现条带,但清晰度欠佳。将相同DNA模板使用Lipase (LIP)引物进行扩增,第一对引物扩增后,除阳性对照外,9份模版中的8份在目的片段大小处出现了浅条带,此后稀释产物,使用第二对引物继续扩增,9份从患者中提取的组织DNA样本均出现了明确均一的目的条带。同批设置空白对照,结果无条带出现。测序后经BLAST比对,明确为P.acnes。2.使用ISH和FISH的方法对FBGT患者脑部液化坏死区域中P.acnes mRNA进行原位杂交后,可观察到阳性信号在组织内分布广泛,多位于细胞内。经核染料DAPI复染后,进一步确认P.acnes的mRNA杂交信号分布于胞内,且在部分视野中可见信号存在于多个核细胞中。同批实验使用正义探针进行原位杂交的患者脑组织中,和反义探针进行原位杂交的正常脑组织内均未出现阳性信号。显示出本实验良好的探针特异性和组织特异性。结论通过nPCR的方法,成功扩增出FBGT患者皮损处和病变脑组织处的病原菌DNA,证明了FBGT患者的脑感染病原体与皮损相同;在此基础上,结合ISH和FISH两种形态学研究方法,成功地将病原菌P.acnes的mRNA定位于FBGT患者的脑组织细胞中,明确了FBGT患者的脑部感染是继发于其面部肉芽肿性皮损的P.acnes感染。