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目的副溶血弧菌(Vibrio Parahaemolyticus,VP)存在于温带和热带海洋系统,引起的食物中毒通常发生在夏季,主要与进食未加工或未煮熟海鲜有关。副溶血弧菌中毒的典型临床症状是急性肠胃炎,常伴有腹痛,腹泻,恶心,呕吐,发烧,发冷和水样大便。在我国沿海地区,由副溶血弧菌引起的食物中毒位居前列。tlh基因编码不耐热溶血毒素(Thermolabile Hemolysin,TLH),是副溶血弧菌的遗传检测过程中的靶向基因,但对其致病机制尚未明确。首次利用毕赤酵母构建针对副溶血弧菌不耐热溶血毒素外源蛋白表达体系,进行表达分泌蛋白并将之沉淀浓缩,验证其分子量及溶血功能,并初步探究不耐热溶血毒素对人食管癌细胞KYSE450增殖的抑制作用,为癌细胞增殖抑制研究和抗癌药物研发提供有价值的参考方向。方法在已经成功采用电转化法把重组表达质粒pPIC9K-tlh转化至毕赤酵母宿主菌SMD1168的完整菌株基础上,活化菌株。选取高拷贝的阳性菌株,在含有甲醇的诱导培养液中分泌产生目的靶蛋白(TLH),取分泌上清液离心后,采用三氯乙酸(Trichloroacetic Acid,TCA)-丙酮沉淀法分离浓缩靶蛋白。进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(Sodium Dodecyl SulfatePolyacrylamide Gel Electrophoresis,SDS-PAGE)验证蛋白大小,添加卵磷脂进行该靶标蛋白溶血功能检测。最后,使用Cell Counting Kit-8(CCK-8)法测定不耐热溶血毒素抑制人食管癌细胞KYSE450生长的量效关系曲线。结果(1)SDS-PAGE结果显示,获得的分泌蛋白分子量大小接近43KD,与文献报道相符,证明目的蛋白成功表达。(2)将卵磷脂加入工程菌株分泌的靶蛋白中,溶血检测结果阳性,而对照组阴性,表明靶蛋白具备依赖卵磷脂酶溶血活性,与不耐热溶血毒素所报道的功能相符,再次验证目的蛋白。(3)人食管癌细胞KYSE450随靶蛋白浓度增加而活度随之降低,初步推测:TLH对人食管癌细胞KYSE450增殖起抑制作用。结论利用毕赤酵母宿主分泌表达胞外不耐热溶血毒素蛋白体系,成功表达TLH;通过实验验证其溶血功能,表明靶蛋白具备卵磷脂依赖性磷脂酶活性,并且溶血程度随着工程菌株的诱导时间增加而增高;CCK-8实验证明其对人食管癌细胞KYSE450增殖起抑制作用。