鼓室硬化的发病机制复杂，目前还存在争论。虽然不同组织和器官硬化的病因、临床表现和自然病程等方面有差别，但鼓室硬化与其他器官硬化在细胞水平和分子水平的纤维化形成过程是相似的。既往的研究已经证明巨噬细胞是鼓室硬化的细胞基础。然而，巨噬细胞参与鼓室硬化的分子机制及其信号通路尚不明料。骨形成蛋白(bonemorphogeneticprotein2，BMP2)是有效的骨生成诱导因子，参与钙化、骨化过程；过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxisomeproliferators—activatedreceptorγ，PPARγ)通路参与器官纤维化、硬化的发生；以上两者在巨噬细胞中均有发现。本研究设计将巨噬细胞株Ana-1和小鼠中耳黏膜成纤维细胞共培养，体外模拟中耳炎症条件，通过检测中耳黏膜成纤维细胞的增殖、BMP2基因表达以及PPAR—γ途径的调控影响，揭示不同激活状态巨噬细胞、BMP2以及PPAR—γ途径在鼓室硬化中的作用，旨在探索鼓室硬化的发生机制，为鼓室硬化防治提供实验依据和研究线索。 本研究分为三章。 第1章巨噬细胞和BMP2在鼓室硬化黏膜组织中的定位和表达 目的:检测巨噬细胞、BMP2在鼓室硬化的中耳黏膜中的定位和表达，探讨巨噬细胞、BMP2在鼓室硬化发生机制中的作用。方法:选取17例鼓室硬化的病例，以及17例年龄、性别、病程相匹配的单纯慢性化脓性中耳炎病例，应用免疫组化的方法检测病变黏膜的巨噬细胞标志CD68、以及BMP2蛋白在两组标本的定位和表达情况。结果:两组中CD68阳染细胞均主要分布于黏膜下层中，黏膜层中仅有少量分布。两组中，阳性病例均为12例(12/17，70.59％)，两组病例的CD68阳染细胞数量无差别(P=0.79)，鼓室硬化组为6.94±6.08，慢性化脓性中耳炎组为7.59±7.84。两组均有BMP2阳染细胞表达，BMP2蛋白广泛表达于中耳黏膜层、黏膜下层。两组的BMP2阳染细胞数及平均光密度值均有显著差异(p＜0.05)。在鼓室硬化组中，钙化斑周围有巨噬细胞浸润和大量BMP2阳性着色，钙化斑周围的部分细胞同时有CD68和BMP2阳性着色。结论:巨噬细胞参与了鼓室硬化，可能通过分泌BMP2在鼓室硬化形成中起重要作用。 第2章不同激活状态巨噬细胞的BMP2基因和PPARγ基因表达及其相关性 目的:通过了解巨噬细胞在不同激活状态下BMP2基因表达的变化以及与PPARγ基因表达的关系；并引入PPARγ配体罗格列酮，了解PPARγ活化与BMP2基因表达的关系；以探讨不同激活状态巨噬细胞的功能。方法:体外培养小鼠巨噬细胞株Ana-1；用脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)和地塞米松(Dexamethasone，DEX)分别激活巨噬细胞，得到经典激活巨噬细胞和选择性激活巨噬细胞，运用酶联免疫吸附剂检测(enzyme—linkedimmunosorbnentassay，ELISA)法和荧光定量逆转录聚合酶链反应(fluorescentquantitativereversetranscriptionpolymerasechainreaction，FQ—RT—PCR法)检测不同激活状态巨噬细胞的BMP2蛋白和基因表达，分析其相关性；再加入罗格列酮培养不同激活状态的巨噬细胞，运用FQ—RT—PCR法检测各组巨噬细胞的BMP2和PPAR—γ的基因表达。结果:不同激活状态巨噬细胞Ana-1的BMP2的蛋白表达与其基因表达呈正相关。选择性激活组巨噬细胞的BMP2蛋白表达和基因表达最高(p＜0.05)，另两组间无显著差异(p＞0.05)。激活组巨噬细胞的PPAR—γ表达虽然较高，但与未激活组比较无显著差异(p＞0.05)。随着罗格列酮浓度增加，三组巨噬细胞的PPARγ基因表达均增高，两激活组于10umol/L达到高峰(p＜0.05)，且选择性激活的巨噬细胞表达最高(p＜0.05)；三组巨噬细胞的BMP2基因表达均显著降低(p＜0.05)。结论:选择性激活的巨噬细胞分泌更多BMP2，后者可能在硬化斑形成中发挥主要作用，可以通过活化PPARγ通路来减弱巨噬细胞的BMP2表达。 第3章不同激活状态巨噬细胞对小鼠中耳粘膜成纤维细胞增殖和分泌BMP2的影响 目的:通过小鼠中耳成纤维细胞与巨噬细胞共培养，检测中耳成纤维细胞的增殖情况与BMP2、PPARγ基因表达的关系，探讨PPARγ通路在防治鼓室硬化的可行性。方法:在与不同激活状态巨噬细胞共培养的中耳成纤维细胞中加入PPARγ特异性配体罗格列酮，运用FQ—RT—PCR法检测各组的BMP2和PPAR—γ的基因表达。并采用细胞计数试剂盒(CCK—8试剂盒)检测各种浓度罗格列酮影响下巨噬细胞株Ana-1、小鼠中耳成纤维细胞的增殖情况以及与不同激活状态巨噬细胞共培养条件下中耳成纤维细胞的增殖情况。结果:中耳成纤维细胞与巨噬细胞共培养后，尤其是与激活的巨噬细胞共培养后，中耳成纤维细胞的BMP2mRNA表达升高。在与激活状态巨噬细胞共培养条件下，中耳成纤维细胞的BMP2mRNA表达和PPARγmRNA表达呈显负相关(r=—0.507p=0.035)。随着罗格列酮浓度增加，四组中耳成纤维细胞PPARγmRNA的表达均升高，10umol/L为最有效浓度，经典激活巨噬细胞共培养组的PPARγmRNA表达始终最高；相反，四组中耳成纤维细胞BMP2mRNA的表达均降低，10umol/L为最有效浓度，选择性激活巨噬细胞共培养组的BMP2mRNA表达始终最高。各种浓度罗格列酮对巨噬细胞株Ana-1、小鼠中耳成纤维细胞的增殖无影响(p>0.05)，与不同激活状态巨噬细胞共培养条件下的各组中耳成纤维细胞增殖无显著差别(p>0.05)。结论:不同激活状态巨噬细胞会影响中耳成纤维细胞的BMP2基因表达，但不是通过干预成纤维细胞的增殖活性来实现；激活PPARγ通路可以减少中耳成纤维细胞的BMP2基因表达，提示PPARγ配体(罗格列酮)能阻止鼓室硬化的发生发展。