【摘 要】
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化石燃料是一种重要的能源资源,占全世界能源需求量的85%,但化石燃料的过度消耗为能源紧缺及环境污染带来了极大的挑战,因此发展可再生能源是当今能源研究的重点。生物燃料是利用动植物及微生物直接或间接生成的清洁能源,其中生物柴油因其安全清洁、燃烧效率高、生产成本低等特点有望替代化石燃料成为新型可再生能源。生物柴油的脂质原料多来源于动植物油脂,如玉米油、大豆油、动物脂肪等,但由于农作物生长缓慢且原料成本高
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化石燃料是一种重要的能源资源,占全世界能源需求量的85%,但化石燃料的过度消耗为能源紧缺及环境污染带来了极大的挑战,因此发展可再生能源是当今能源研究的重点。生物燃料是利用动植物及微生物直接或间接生成的清洁能源,其中生物柴油因其安全清洁、燃烧效率高、生产成本低等特点有望替代化石燃料成为新型可再生能源。生物柴油的脂质原料多来源于动植物油脂,如玉米油、大豆油、动物脂肪等,但由于农作物生长缓慢且原料成本高从而使其推广受到限制。近年来,光合效率高、遗传背景清晰、生长迅速的单细胞蓝藻类生物逐渐得到重视,其中聚球藻PCC7002（Synechococcus sp.PCC7002）作为蓝藻模式生物已被广泛应用于光合系统、代谢工程、生物燃料等领域的研究。本研究利用聚球藻PCC7002 WT为模式藻株,通过敲除和过表达中心代谢系统中的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PEPC）基因ppc,从而构建PCC7002（？）ppc::Sp及PCC7002-ppc+藻株,通过检测工程藻株的生化指标及脂肪酸成分,同时对参与三酰甘油（TAG）和游离脂肪酸（FFAs）合成的相关基因进行定量分析,阐述了PEPC途径对蓝藻脂质合成的调控作用。主要研究内容及结果如下:1.利用PCR的方法构建ppc敲除盒及过表达盒,随后通过自然转化将线性DNA转入PCC7002中,通过抗生素筛选和分子验证成功构建PCC7002（？）ppc::Sp及PCC7002-ppc+工程藻株;2.分别利用分光光度法、细胞干重法、蒽酮比色法、BCA法以及Bligh&Dyer法动态测定细胞生长、生物质积累、总糖、总蛋白质和总脂质含量。结果表明敲除ppc使藻细胞生长和生物质积累明显受到抑制,且糖原和蛋白质含量显著降低,但脂质含量显著提高,并在生长后期脂质合成趋于稳定甚至降低;过表达ppc基因对细胞生长、生物质积累、蛋白质含量和脂质含量变化无明显影响,但糖原合成和积累显著增加。3.利用气相色谱-火焰离子化检测器（GC-FID）分析藻细胞内FFAs组分及含量,结果表明三种藻株均含有C16:0、C16:1、C18:0、C18:1、C18:2和C18:3等FFAs,且前四种百分含量占据总FFAs的70-90%,其余为多不饱和脂肪酸（PUFAs）,其中ppc工程藻内C16:0百分含量明显高于WT,而C18:0则低于WT。相对定量分析结果表明过表达ppc可显著提高C16:0含量,但对其它FFAs浓度无显著影响,而敲除ppc后C16:0、C18:0、C18:1合成及含量显著升高,而C16:1和PUFAs则无明显变化。4.利用qRT-PCR分析藻细胞在指数中期时涉及TAG和FFAs合成的相关基因表达差异。结果表明敲除ppc后细胞内gps A、pls C和fab D等基因的表达水平较WT显著上调,但acc A基因表达无显著变化;而过表达ppc基因对gps A、pls C和fab D等基因的m RNA水平变化无明显影响,但acc A基因表达量却显著升高。总之,本研究阐述了PEPC途径对蓝藻脂质代谢具有一定调控作用,且敲除ppc可显著提高脂质合成和积累从而为生物柴油提供前体分子,因此ppc基因可能是以工程蓝藻生物质为原料生产生物柴油的潜在靶点,并为生物燃料的研究提供了新的理论依据及视角。
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