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目的:结核病是全球传播最广泛、严重影响人类健康的传染病之一，为此各国都在积极寻找防治结核病切实有效的措施。自上世纪Wolff等人提出DNA疫苗的概念以来，关于结核病的免疫研究成为结核病研究的热点之一。抗原85(Antigen85)，是由结核杆菌和BCG等分枝杆菌分泌的、由Ag85A、Ag85B、Ag85C所组成的复合物，其中Ag85A在Ag85组成成分中所占比例最高。有研究表明，给小鼠接种含Ag85A基因片段构建的质粒后，可诱导产生强烈的体液免疫与细胞免疫应答以抵御结核分枝杆菌的感染。DNA疫苗通常由病原体抗原基因片段与载体组成，载体通常含有强病毒启动子以驱动目的基因在细胞内或动物体内的转录和翻译。DNA疫苗经典抗原提呈方式为疫苗接种后首先转录翻译成蛋白质抗原，再经抗原提呈细胞(APC)等通过内源性、外源性和交叉性方式提呈抗原信息给免疫细胞，诱导适应性免疫应答。最新文献表明抗原提呈细胞的细胞浆和内体含有能够识别DNA的传感器，DNA传感器可识别病毒和细菌的核酸，启动激活免疫信号通路，诱导固有和适应性免疫应答产生。本课题的前期研究发现，采用含Ag85A基因的重组质粒自制的Ag85A DNA疫苗，于体外稳定转染的DC2.4细胞内可查到Ag85A mRNA的转录，查不到蛋白的表达，但能诱导细胞表面CD80和CD86表达上调;特别是将转染Ag85A DNA疫苗的DC2.4细胞输注给小鼠后，可诱导小鼠产生适应性细胞和体液免疫应答。这一结果提示，DC2.4细胞有可能通过细胞内的某种DNA或RNA传感器分子及相关信号转导途径传出Ag85A免疫原性信息，刺激T细胞免疫应答及体液免疫应答。本研究采用本课题组构建的二种质粒，即含正常Ag85A基因片段的质粒（简称正常质粒）和含突变Ag85A基因片段的质粒（简称突变质粒）制成Ag85A DNA疫苗，证明突变质粒制备的疫苗在DC2.4细胞内仅表达Ag85AmRNA，不表达Ag85A蛋白分子;并初步验证了Ag85A DNA疫苗瞬时转染的DC2.4细胞未显示通过DNA传感器传递双股DNA疫苗中Ag85A的免疫原性信息。 研究方法:1、二种重组质粒pIRES2-EGFP-Ag85A转染DC2.4细胞。利用Lipofectamine3000试剂包裹二种重组质粒，分别对DC2.4细胞进行转染，同时设立pIRES2-EGFP空质粒转染组、Lipofectamine3000试剂组和空白组进行对照，共5组细胞。转染后48h收获细胞。2、Real-time RT-PCR法检测瞬时转染细胞Ag85A基因mRNA表达。分别提取瞬时转染后各组细胞总RNA，将提取的RNA反转录为cDNA后进行Real-time RT-PCR实验，检测5组细胞内Ag85A基因mRNA的表达情况。3、免疫印迹法检测瞬时转染细胞Ag85A蛋白分子表达。pIRES2-EGFP-Ag85A正常质粒组、pIRES2-EGFP-Ag85A突变质粒组和空质粒组瞬时转染细胞分别提取细胞蛋白质，用免疫印迹法检测3组细胞内Ag85A蛋白分子表达，空质粒组作为阴性对照。4、瞬时转染DC2.4细胞细胞因子表达水平检测。取5组细胞mRNA反转录后的cDNA，采用Real-time RT-PCR法检测IL-1β、IL-6、IL-12p40mRNA表达水平，用ELISA法检测瞬时转染细胞培养基上清中IL-6及IL-12p40的蛋白分泌水平。5、Real-time RT-PCR法检测瞬时转染细胞各DNA传感器mRNA表达。取5组细胞mRNA反转录后的cDNA，用Real-time RT-PCR检测DNA传感器mRNA的表达水平。 结果:1、瞬时转染后，Real-time RT-PCR结果显示检测到pIRES2-EGFP-Ag85A正常质粒组与突变质粒组表达Ag85A mRNA，空质粒转染组、Lipo组和空白组均未检测出Ag85A mRNA的表达。2、瞬时转染后，免疫印迹法结果显示pIRES2-EGFP-Ag85A正常质粒组可检测到Ag85A蛋白分子表达，pIRES2-EGFP-Ag85A突变质粒组、空质粒组未检测出Ag85A蛋白质的表达。3、IL-1β和IL-6的mRNA表达水平在正常质粒组、突变质粒组和空质粒组均升高，IL-6蛋白在正常质粒组、突变质粒组和空质粒组表达升高。未检出5组细胞表达IL-12p40mRNA与分泌IL-12p40蛋白。4、DAI传感器表达量在三组质粒转染组非特异性升高，其余DNA传感器在5组细胞中不表达或表达量维持不变。 结论:1、采用重组突变质粒(pIRES2-EGFP-Ag85A)制备的Ag85A DNA疫苗瞬时转染的DC2.4细胞可转录mRNA，不表达Ag85A蛋白分子;采用正常质粒(pIRES2-EGFP-Ag85A)制备的Ag85A DNA疫苗瞬时转染的DC2.4细胞可转录mRNA，也表达Ag85A蛋白分子。2、Ag85A DNA疫苗瞬时转染的DC2.4细胞未显示通过DNA传感器传递双股DNA疫苗中Ag85A的免疫原性信息。