前言：随着分子生物学及生物技术的迅速发展,近年来基因治疗的基础研究与应用得到了长足的进步。在基因疗法的研究中,基因传输是成功进行基因治疗的一个关键步骤,其中靶向、非侵袭的基因输送系统因其诸多优点成为基因疗法研究中的一个热点,在临床上具有重要的潜在应用价值。虽然传统的病毒基因载体具有较高的基因转染效率,但该类方法的安全性和长期疗效受到质疑,限制了其临床应用。近几年,非病毒基因载体引起了研究者的关注并得到了广泛研究。但目前的研究表明,单纯的非病毒载体基因转染率不高,导致基因治疗效果明显受限。超声靶向微泡破坏技术(Ultrasound-targeted microbubble destruction,UTTMD)是一种靶向、高效、有广阔应用前景的非病毒基因输送新策略,其通过诱发细胞膜声孔作用,增加膜通透性,进而有效促进大分子物质的胞内传输,且可避免其他基因传输方法的副作用。在该类方法的研究中,UTMD的参数设置与优化组合对基因转染效率有至关重要的影响。本论文将对UTMD的参数进行详细分析与优化,为靶向、高效、无创的基因治疗研究提供一种可行的实验方案。　　 脑红蛋白(neuroglobin,Ngb)是2000年由德国Burmester等首先发现的一种携氧球蛋白,是继血红蛋白(Hb)和肌红蛋白(Mb)之后的第三种携氧球蛋白。主要在神经元、视网膜和一些内分泌组织细胞中表达。Ngb能够可逆性地结合氧,且与氧有很高的亲和力,能够特异性地向脑组织供氧,在神经系统氧的摄取、运输和利用等生理过程中起着极其重要的作用。即使血氧浓度较低,与氧具有很高亲和力的Ngb仍将促进氧向线粒体的扩散或直接介导氧向线粒体的传递,促进ATP的产生,从而维持正常神经元的功能。Ngb与氧结合的特性,对缺血缺氧疾病的研究提供了新的思路。已有研究表明脑红蛋白能够保护神经元免受缺氧损伤。值得一提的是Ngb在视网膜内的分布。视觉信息传导过程中需要消耗大量的氧气,因此视网膜是人体耗氧量最大的组织之一。视网膜中Ngb的含量是大脑中的100倍,Ngb在大脑中的浓度约为1μmol/L,而其在视网膜中的浓度大于100μmol/L,和肌肉组织中肌红蛋白的含量相似。Ngb分布于除色素上皮以外的所有视网膜神经细胞内,尤其是耗氧较多的网状层和外核层。Ngb的这种分布与亚细胞结构线粒体的分布以及各部位对氧气的相对需求有密切关系。通过杂交分析方法获知,Ngb在光感受细胞的内节上,内、外颗粒层(其中外颗粒层上包含Müller细胞)和神经视网膜的节细胞层上显现强杂交信号。这些都是视网膜主要消耗氧的位置,属于高需氧区,因为这里有很多突触连接区域。亚细胞定位光感受器时发现。Ngb主要在有大量线粒体的内节顶端椭圆区。Ngb与视网膜之间诸多的特异性为我们进行缺血缺氧视网膜疾病的研究带来了全新的令人振奋的思路和方向。　　 本研究利用UTMD技术将外源性靶向基因Ngb转染至SH-SY5Y细胞中和大鼠视网膜中,在此基础上,进一步探讨外源性Ngb过表达对氯化钴诱导的SH-SY5Y细胞缺氧损伤和大鼠视网膜急性缺血损伤的神经保护作用。本文包括以下四部分:　　 第一部分、大鼠Ngb基因的克隆、序列分析以及真核表达载体构建目的克隆大鼠Ngb基因以及构建真核表达载体。　　 方法：从雄性SD大鼠脑组织中提取总RNA,经逆转录PCR得到cDNA,测序并利用BLAST工具对比证明该基因序列正确。将得到的Ngb基因序列亚克隆入pAcGFP1-C1载体中,并通过双酶切和测序确定序列正确。　　 结果：克隆了SD大鼠的Ngb基因,与参考序列完全一致,没有碱基发生突变。真核表达载体酶切片段和测序表明插入片段序列正确。　　 结论：SD大鼠脑组织中有Ngb表达,获得了Ngb基因的表达序列,并成功构建了Ngb真核表达载体。为以后的研究提供了重要的实验材料。　　 第二部分、超声靶向微泡破坏技术参数设置与优化增强基因转染的研究目的探讨不同超声强度、辐照时间、占空比以及微泡浓度对细胞存活率和基因转染效率的影响。　　 方法：贴壁培养SH-SY5Y细胞,设置不同超声强度、占空比、微泡浓度及超声时间,利用胎盘蓝染色方法比较不同参数对细胞存活率的影响,利用流式细胞仪检测绿色荧光蛋白基因(GFP)转染效率的影响,CCK-8检测对比转染前后细胞活力。　　 结果：超声强度0.8w/cm2、占空比50％、微泡浓度20％及超声时间60s时,细胞成活率最高,转染效率最高。转染前后细胞活力比较无显著性差异。　　 结论：不同超声染参数对细胞活力和转染效率有较大影响,对其优化后可减少细胞损伤及提高转染效率。超声联合微泡对超声介导基因转染有显著的增效作用。UTMD能显著增加目的基因转染,是一种高效、非侵袭性的基因转染方法。　　 第三部分、Ngb基因过表达对氯化钴诱导SH-SY5Y细胞缺氧损伤的神经保护作用目的探讨超声靶向微泡破坏介导的Ngb过表达对CoCl2诱导SH-SY5Y细胞缺氧缺氧损伤的保护作用　　 方法：优化完UTMD参数后,将SH-SY5Y细胞分成空白对照组(正常培养),空质粒转染组,重组质粒转染组,培养液为DMEM,加入一定浓度的氯化钴(250mM)诱导细胞化学缺氧,在诱导缺氧后0、2、6、12及24小时分别检测不同组别的caspase-3的活性。Western blot和RT-PCR检测空白对照组与重组质粒转染组细胞缺氧时Ngb表达的变化情况。　　 结果：重质粒组细胞的caspase-3活性远远低于空白对照组及空质粒组。Western blot和RT-PCR结果Ngb在CoCl2诱导缺氧后表达上调,在12小时达到峰值,缺氧后期Ngb表达下降,但仍高于缺氧前水平。　　 结论：急性缺氧可以诱导Ngb表达上调。UTMD介导的Ngb基因过表达对氯化钴诱导SH-SY5Y细胞缺氧损伤具有神经保护作用。空质粒pAcGFP1-C1作为一个基因载体没有神经保护作用。　　 第四部分、探讨Ngb基因过表达对大鼠视网膜急性高眼压损伤的神经保护用目的探讨超声靶向微泡破坏介导的Ngb过表达对大鼠急性高眼压损伤的神经保护作用。　　 方法：利用UTMD技术将重组质粒转染至大鼠视网膜组织,提高Ngb表达水平。将大鼠分为转染组和未转染组,在转染后48小时,制作急性高眼压模型,通过westernblot检测Ngb在急性高眼压时表达的变化情况,比较转染组和未转染组caspase-3活性。　　 结果：未转染组大鼠在视网膜急性缺血时,Ngb表达反应性增加,在10min达到峰值,随后呈下降趋势,在60min时,表达量降至低点。转染组Ngb表达缓慢上调,在30min达到峰值。转染组Ngb过表达可以降低视网膜对急性缺血缺氧敏感性。转染组caspase-3活性远远低于未转染组。　　 结论：UTMD能够在体内安全、有效地介导Ngb基因转染视网膜组织中。Ngb过表达可以降低视网膜对缺氧的敏感性,起到神经保护作用。