恶性黑色素瘤(malignant melanoma,MM)是常见的肿瘤类型,主要发生于皮肤组织,其次发生于粘膜和眼。该病的主要临床特征是易转移、预后差,在浅肤色人群中发病率较高。恶性黑色素瘤是多种因素导致的疾病,包括环境因素和遗传因素等。因此,深入研究基因表达和调控在黑色素瘤发生发展中的作用是极其重要的。microRNA(miRNA)是一类非编码的RNA,可通过与靶mRNA的3’-UTR区结合而导致mRNA的降解,或抑制蛋白的翻译。多项研究发现miRNA可影响黑色素瘤的发生和发展过程。miR-145-5p已经在多种癌症中作为抑癌基因被报道过,如胃癌、喉鳞癌、前列腺癌等。在胃癌中研究发现,miR-145-5p通过靶向作用N-cadherin和ZEB2,进而抑制上皮间质转化,从而可以抑制胃癌侵袭性。另外,检测发现miR-145-5p的表达与胃癌的Lauren分型、肿瘤浸润深度、淋巴结转移和TNM分期密切相关。miR-145-5p在喉鳞癌中显著下调,且miR-145-5p低表达可以促进靶基因FSCN1的表达,从而促进喉鳞癌细胞增殖、侵袭、转移、间质转化等,扮演抑癌基因角色。在前列腺癌中,miR-145-5p过表达可以抑制SOX2的表达,进而可以抑制前列腺癌细胞的增殖。有研究在黑色素瘤中检测发现,与癌旁组织相比,miR-145-5p在黑色素瘤中表达明显降低,且miR-145-5p可以通过靶向调控NRAS,进而抑制MAPK和PI3K/Akt通路,从而影响黑色素瘤细胞的增殖、凋亡、迁移和侵袭。研究发现,与正常皮肤组织相比,TLR4在皮肤恶性黑色素瘤中表达明显上调,且脂多糖(LPS)活化TLR4可以显著上调Foxp3的表达,进而参与恶性黑色素瘤的免疫逃逸。本研究前期通过生物信息学软件Targetscan、picTar、miRanda预测发现,TLR4是miR-145-5p的靶基因。到目前为止,TLR4作为miR-145-5p的靶基因在恶性黑色素瘤发生和发展中的作用及机制还未有研究。据研究,NF-κB信号通路与癌症的多种生物学过程相关。例如:在胃癌中,siRNA阻断NF-κB信号通路能够抑制胃癌SGC-7901细胞的增殖及侵袭。在肝癌中,蒽贝素(Embelin)能够通过阻断NF-κB信号通路,进而可以抑制肝癌细胞Bel-7404的增殖,同时诱导细胞凋亡,从而抑制肝癌的发展。目前,关于miR-145-5p是否通过调控NF-κB信号通路影响黑色素瘤发生和发展的研究至今还未有报道。本课题为研究miR-145-5p在恶性黑色素瘤发生发展中的作用及机制,首先使用qRT-PCR检测了miR-145-5p在恶性黑色素瘤中的表达情况,并分析了miR-145-5p的表达与临床病理参数的关系;另外探究了miR-145-5p对黑色素瘤细胞增殖、克隆形成、凋亡、迁移、侵袭和NF-κB信号通路的影响,并利用双荧光素酶报告基因实验验证了miR-145-5p和TLR4的靶向关系,探讨了miR-145-5p靶向TLR4对黑色素瘤细胞生物学行为以及NF-κB信号通路的影响;最后行裸鼠体内研究,利用黑色素瘤细胞移植构建了裸鼠移植瘤模型,探究了miR-145-5p过表达对TLR4表达、裸鼠移植瘤生长以及NF-κB信号通路的影响。本研究分为以下三部分:第一部分:miR-145-5p在恶性黑色素瘤中的表达及意义研究;第二部分:miR-145-5p对恶性黑色素瘤细胞生物学行为的调控作用研究;第三部分:miR-145-5p对黑色素瘤细胞裸鼠移植瘤的抗肿瘤作用研究。主要内容:第一部分:miR-145-5p在恶性黑色素瘤中的表达及意义研究方法1.qRT-PCR检测miR-145-5p在恶性黑色素瘤和正常组织中的表达差异。2.qRT-PCR检测miR-145-5p在不同分期黑色素瘤中的表达差异。3.分析miR-145-5p在黑色素瘤中的表达与临床病理参数的关系。结果1.与正常组织相比,miR-145-5p在恶性黑色素瘤中明显低表达。2.miR-145-5p在黑色素瘤Stage1/2中的表达水平明显高于Stage3/4。3.黑色素瘤中miR-145-5p的表达与患者性别、年龄、肿瘤部位、溃疡均无明显关系,与黑色素瘤分期有关。第二部分:miR-145-5p对恶性黑色素瘤细胞生物学行为的调控作用研究方法1.构建miR-145-5p过表达、miR-145-5p干扰,及TLR4过表达慢病毒载体,并进行病毒包装和滴定。2.qRT-PCR检测miR-145-5p在正常黑色素细胞(Melanocytes)、黑色素瘤细胞A375、WM35、VMM5A、M14、A875和HMCB中的表达情况。3.重组慢病毒感染A375、M14细胞,筛选得到稳定细胞系。4.使用MTT、克隆形成实验、划痕实验、流式细胞术、Transwell小室实验检测转染miR-145-5p、sh-miR-145-5p或miR-145-5p+TLR4的A375和M14细胞的增殖、克隆形成、迁移、凋亡和侵袭能力。5.ELISA检测转染miR-145-5p、sh-miR-145-5p或miR-145-5p+TLR4的A375和M14细胞中Caspase3和NF-κB的活性。6.在线生物信息学软件预测miR-145-5p和TLR4的靶向关系。双荧光素酶报告基因实验验证miR-145-5p和TLR4的靶向关系。7.qRT-PCR检测A375、M14细胞中miR-145-5p对TLR4 mRNA表达的影响。8.利用Western blot检测转染miR-145-5p、sh-miR-145-5p或miR-145-5p+TLR4的A375和M14细胞中TLR4、NF-κB p65、MMP-2、MMP-7以及Ki67蛋白的表达情况。结果1.qRT-PCR检测发现,与正常黑色素细胞相比,miR-145-5p在黑色素瘤细胞A375、WM35、VMM5A、M14、A875和HMCB中明显低表达,其中在A375、M14细胞中表达最低,所以我们选择A375、M14细胞系作为本研究使用的细胞材料。2.与对照组相比,miR-145-5p在miR-145-5p转染组A375和M14细胞中表达明显升高,而miR-145-5p在miR-145-5p干扰组中表达明显降低。说明miR-145-5p过表达和干扰细胞系分别构建成功。3.在A375和M14细胞中,miR-145-5p过表达明显抑制细胞的增殖、克隆形成、侵袭和迁移,抑制NF-κB活性以及NF-κB p65的表达,并促进细胞凋亡,而miR-145-5p干扰则促进细胞增殖、克隆形成、侵袭和迁移,促进NF-κB活性以及NF-κB p65的表达,并抑制细胞凋亡。4.Targetscan在线软件预测TLR4是miR-145-5p的靶基因,且双荧光素酶报告基因载体实验也证实TLR4是miR-145-5p的靶基因。在A375和M14细胞中,miR-145-5p过表达可以明显抑制TLR4的表达,而miR-145-5p受干扰则促进TLR4的表达。5.在A375和M14细胞中,miR-145-5p过表达可以靶向抑制TLR4的表达,抑制细胞的增殖、克隆形成、侵袭和迁移,并抑制NF-κB活性以及NF-κB p65、MMP-2、MMP-7以及Ki67的表达,并促进细胞凋亡。第三部分:miR-145-5p对黑色素瘤细胞裸鼠移植瘤的抗肿瘤作用研究方法1.利用黑色素瘤细胞A375构建移植瘤裸鼠模型,并定期检测移植瘤的体积,30天后处死小鼠检测移植瘤的重量。2.Western blot检测移植瘤中TLR4和NF-κB p65蛋白的表达。3.ELISA检测miR-145-5p过表达对移植瘤中NF-κB活性的影响。结果1.成功构建Con、miR-145-5p移植瘤裸鼠模型。移植瘤体积和重量检测结果表明miR-145-5p过表达显著抑制黑色素瘤移植瘤的生长。2.miR-145-5p过表达抑制移植瘤中TLR4的表达及NF-κB信号通路的活性。全文结论相较于正常皮肤组织,miR-145-5p在恶性黑色素瘤中明显低表达,且miR-145-5p的表达与黑色素瘤分期有关。在A375和M14细胞中,miR-145-5p过表达可以抑制细胞增殖、克隆形成、迁移和侵袭,并促进细胞凋亡,这一过程可能是其通过靶向TLR4抑制NF-κB通路的活性实现的。裸鼠体内实验进一步证实miR-145-5p过表达能够通过靶向TLR4,进而抑制NF-κB信号通路的活性,抑制黑色素瘤的生长,这为黑色素瘤临床治疗提供了一定的实验基础和理论依据。