研究目的:血管新生在多种生理和病理生理过程中发挥着重要作用。血管新生异常与多种临床疾病,如中风、心脏缺血梗死、肢体缺血性坏死和动脉粥样硬化等密切相关。组织缺血后一般通过激活HIF-1α和VEGF信号通路促进内皮细胞增殖、迁移并最终形成新的血管。另外,组织缺血后常常导致多种炎症细胞浸润,组织内炎症因子堆积。缺血后的组织炎症反应对血管新生过程亦发挥着至关重要的作用。PD-1是一个重要的免疫检查点抑制剂,对维持机体免疫稳态具有重要作用。大量的临床和基础研究表明PD-1是治疗多种肿瘤和自身性免疾病的一个有效药物研究靶点。虽然抑制PD-1信号通路可有效治疗多种肿瘤的发生发展,但抑制PD-1信号通路也导致了部分病人心血管系统的严重毒副作用。鉴于PD-1对机体免疫反应和组织炎症反应的重要作用以及PD-1抑制剂在癌症病人中的广泛应用,本实验的主要目的是研究PD-1在缺血后血管新生能力的作用及作用机制。研究方法:本课题分别采用PD-1基因敲除(PD-1 KO)小鼠以及通过对野生型C57BL/6小鼠进行PD-1阻断抗体(PD-1m Ab)治疗的方法对PD-1进行了特异抑制,并通过流式细胞术分析、免疫荧光分析、HE染色分析、马松染色分析、荧光定量PCR分析和ELISA分析等多种分子生物学手段,综合研究了PD-1对小鼠股动脉结扎缺血后下肢血流灌注、小鼠运动能力、组织内炎症反应、氧化应激及血管新生能力的作用及作用机制。鉴于PD-1基因敲除导致血管新生能力降低及组织内IFN-γ产生增加,我们进一步研究了IFN-γ对血管内皮细胞增殖、迁移、管形成和凋亡的影响。研究结果:1.PD-1基因敲除损害了小鼠缺血后下肢的血流灌注能力、血管新生能力和缺血后运动能力的恢复,并加重了缺血骨骼肌萎缩和纤维化PD-1基因敲除小鼠和野生型小鼠相比,在缺血手术前血流灌注无显著差异。与野生型小鼠相比,PD-1基因敲除小鼠在缺血后第14天和21天血流灌注均显著低于野生型小鼠。提示,PD-1基因敲除抑制了小鼠缺血后下肢的血流灌注能力。因在缺血后第7天PD-1敲除小鼠和野生型小鼠血流灌注无显著差异,而在缺血第14天PD-1基因敲除小鼠血流灌注显著低于野生型小鼠。因此,为了探究造成这种差异的原因是否与血管新生相关,我们对缺血后第7天和14天的毛细血管新生情况进行了检测。结果发现,PD-1基因敲除小鼠与野生型小鼠相比,在缺血后第7天新生毛细血管数量无显著差异,在缺血后第14天新生毛细血管数量显著低于野生型小鼠。结果提示,PD-1基因敲除抑制了缺血后下肢骨骼肌的血管新生能力。缺血后运动能力的恢复受血流灌注的调控,因此我们对小鼠运动能力进行了检测。结果发现,PD-1基因敲除小鼠与野生型小鼠相比,在缺血手术前两组小鼠之间运动能力(最大运动速度、达到最大运动速度的时间和距离)无显著差异。在缺血后第14天和21天,PD-1基因敲除小鼠的运动能力显著低于野生型小鼠。提示,PD-1基因敲除抑制了小鼠缺血后运动能力的恢复。小鼠缺血骨骼肌的萎缩和纤维化受血流灌注的调控。我们发现,在缺血后第21天,PD-1基因敲除小鼠缺血腓肠肌再生肌纤维面积显著低于野生型小鼠,而腓肠肌纤维化面积百分比显著高于野生型小鼠。提示,PD-1基因敲除加重了缺血骨骼肌萎缩和纤维化。2.PD-1基因敲除加重了小鼠缺血后肢骨骼肌炎症反应和氧化应激HE及CD45免疫荧光染色发现,在缺血前PD-1基因敲除小鼠和野生型小鼠腓肠肌中无炎症细胞浸润。在缺血后第3天,两组腓肠肌中炎症细胞浸润均显著增加,且PD-1基因敲除小鼠缺血腓肠肌中CD45炎性细胞浸润数量显著高于野生型小鼠。除此之外,我们通过流式细胞术检测缺血骨骼肌中炎性细胞浸润情况。结果发现,在缺血后第3天与野生型小鼠相比,PD-1基因敲除小鼠缺血骨骼肌中CD45+细胞数量显著增加、CD45+细胞量/骨骼肌质量显著增加、巨噬细胞(F4/80+CD11b+)数量显著增加、巨噬细胞数量/骨骼肌质量显著增加。提示,PD-1基因敲除促进了缺血骨骼肌中炎性细胞浸润。炎症细胞与氧化应激密切相关。通过DHE染色对骨骼肌氧化应激进行检测。发现,PD-1基因敲除小鼠与野生型小鼠相比,未缺血腓肠肌中活性氧族含量无显著差异。在缺血后第3天,PD-1基因敲除小鼠缺血腓肠肌中ROS阳性细胞数量和荧光强度均显著高于野生型小鼠。通过荧光定量PCR对多种炎症因子检测发现,与未缺血组织相比,缺血后第3天MCP-1、IFN-γ、IL-6和IL-1βm RNA表达均显著增加。在缺血后第3天,与野生型小鼠缺血腓肠肌相比,PD-1基因敲除小鼠缺血腓肠肌中IFN-γm RNA表达显著增加,而其它炎症因子m RNA表达无显著变化。此外,ELISA结果显示,PD-1基因敲除小鼠和野生型小鼠未缺血腓肠肌中IFN-γ蛋白表达无显著差异。在缺血后第3天,PD-1基因敲除小鼠缺血腓肠肌中IFN-γ蛋白表达显著高于野生型小鼠。提示,PD-1基因敲除增加了缺血骨骼肌中IFN-γ的表达。3.IFN-γ促进了HUVEC凋亡,损害了HUVEC增殖、迁移和管形成我们发现PD-1基因敲除损害了缺血后血管新生并增加了IFN-γ的产生。推测IFN-γ可能通过调节内皮细胞的生长和存活调节缺血后的血管新生。结果发现,与对照组相比,IFN-γ处理组,HUVEC凋亡显著增加,增殖、迁移和管形成受到显著抑制。4.PD-1基因敲除促进了缺血腓肠肌中炎症细胞产生IFN-γ和TNF-α在前面实验中我们发现,PD-1基因敲除增加了缺血骨骼肌中IFN-γ蛋白的表达,但不能明确其细胞来源,因此我们进行了此部分的检测。我们发现缺血第3天,与野生型小鼠缺血骨骼肌相比,PD-1基因敲除小鼠缺血骨骼肌中IFN-γ阳性细胞占CD45+白细胞百分比显著增加,总IFN-γ阳性白细胞数量显著增加,总IFN-γ阳性白细胞数量/骨骼肌质量显著增加,IFN-γ阳性白细胞平均荧光强度(MFI)也显著高于野生型小鼠。另外,我们同时发现PD-1基因敲除未显著影响缺血骨骼肌中CD45阴性细胞IFN-γ的产生。提示,PD-1基因敲除促进了缺血骨骼肌中白细胞产生IFN-γ。巨噬细胞是缺血骨骼肌中浸润的主要炎性细胞。对巨噬细胞IFN-γ表达进行分析发现,与野生型小鼠缺血骨骼肌相比,在缺血后第3天,PD-1基因敲除小鼠缺血骨骼肌中IFN-γ阳性细胞占巨噬细胞百分比显著增加,总IFN-γ阳性巨噬细胞数量显著增加,总IFN-γ阳性巨噬细胞数量/骨骼肌质量显著增加,IFN-γ阳性巨噬细胞MFI也显著增加。提示,PD-1基因敲除促进了缺血骨骼肌中巨噬细胞产生IFN-γ。此外,我们对缺血骨骼肌中炎症细胞TNF-α产生进行检测。结果发现,与野生型小鼠相比,PD-1基因敲除小鼠缺血骨骼肌中CD45+白细胞TNF-α阳性细胞所占比例、总TNF-α阳性CD45+细胞数量和CD45+细胞TNF-αMFI均无显著变化,但总TNF-α阳性的CD45+细胞数量/骨骼肌质量显著增加。我们同时发现PD-1基因敲除未显著影响缺血骨骼肌CD45阴性细胞的TNF-α产生。与野生型小鼠相比,PD-1基因敲除小鼠缺血骨骼肌巨噬细胞细胞中TNF-α阳性细胞所占比例无显著变化,总TNF-α阳性巨噬细胞数量无显著变化,但总TNF-α阳性的巨噬细胞数量/骨骼肌质量显著增加,而巨噬细胞TNF-αMFI无显著变化。5.PD-1 m Ab抑制了小鼠缺血后肢血流恢复、血管新生和运动能力的恢复并加重了缺血骨骼肌萎缩和纤维化血流灌注分析发现,在手术前,PD-1 m Ab组小鼠和Ig G组相比其血流灌注无显著差异。而缺血后第14天和21天,PD-1 m Ab组小鼠血流灌注显著低于Ig G组小鼠。提示,PD-1 m Ab抑制了小鼠缺血后肢血流恢复。对缺血后第21天血管新生情况进行检测发现,PD-1 m Ab组小鼠后肢缺血腓肠肌中毛细血管数量显著低于Ig G组小鼠。提示,PD-1 m Ab抑制了小鼠缺血后肢血管新生。缺血后运动能力的恢复受血流灌注的调控。对小鼠运动能力检测发现,在缺血手术前PD-1 m Ab小鼠和Ig G小鼠的运动能力无显著差异。而在缺血后第21天,PD-1 m Ab小鼠在跑台上达到的最大运动速度、运动持续时间和运动距离显著低于Ig G组小鼠。提示,PD-1 m Ab抑制了小鼠缺血后运动能力的恢复。缺血后血流灌注情况也会影响缺血骨骼肌的萎缩和纤维化。我们发现在缺血后第21天,PD-1 m Ab组小鼠再生肌纤维面积显著低于Ig G组小鼠,而腓肠肌纤维化面积显著高于Ig G组小鼠。提示,PD-1 m Ab加重了小鼠缺血后肢腓肠肌萎缩和纤维化。研究结论:PD-1基因敲除或药理学抑制,损害了缺血腓肠肌组织内的血管新生、血流恢复和运动能力的恢复,并加重了腓肠肌萎缩和纤维化。PD-1基因敲除提高了缺血腓肠肌氧化应激水平,促进了炎症细胞浸润并提高了IFN-γ表达。IFN-γ的增加,可能主要来源于浸润的炎症细胞。而IFN-γ可直接抑制血管内皮细胞的增殖、迁移、管形成以及促进凋亡而损害血管新生。这些结果表明PD-1在缺血后血流灌注恢复和血管新生中发挥重要作用,PD-1可通过调节炎症反应参与缺血后血流灌注恢复和血管新生的调控。