家蚕Ssu72蛋白基因的初步研究

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Ssu72(Suppresso.o.sua7-.clon.2)蛋白的命名源于它对酵母的sua7-1基因突变的抑制作用。该蛋白具有很高的保守性,但在细菌或者古细菌中没有发现Ssu72的同源物,所以Ssu72蛋白很可能是真核生物所特有的一种蛋白质。目前关于Ssu72蛋白的研究有很多,推测它在真核生物RNA聚合酶II作用的转录过程中有可能具有重要的功能:涉及转录起始位点的选择;具有磷酸酶的活性;与剪切和多聚腺苷酸化因子(cleavag.an.polyadenylatio.factor.CPF)相结合;平衡转录的延长和终止等。但Ssu72蛋白确切的功能和作用机理仍不清楚。   我们从本实验室构建的家蚕蛹期cDNA文库中筛选到一条序列,对其进行生物信息学分析,发现此序列包含一个57.bp的开放阅读框(ope.readin.frame,ORF),编码一个由192个氨基酸组成的蛋白,预测分子量为22.3.kDa,等电点为5.04。由于其所编码的蛋白含有一个完整的Ssu72保守结构域,且与其它物种的Ssu72蛋白有很高的同源性,所以将家蚕中的这个基因命名为BmSsu72。通过PCR扩增得到BmSsu72基因的完整ORF序列,将其插入到pET-28a(+)表达载体的Bam.I和Xh.I酶切位点之间,获得重组质粒pET-28a(+)-BmSsu72。将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)细胞,IPTG诱导表达含有His标签的BmSsu72融合蛋白,分子量为25.9.kDa,与理论分子量大小一致。对重组菌超声破碎,用镍亲和柱纯化得到较纯的蛋白。用纯化的蛋白作为抗原免疫一只雄性新西兰大白兔,获得多克隆抗血清,间接ELISA法测得抗体效价达1:12800以上。应用荧光定量PCR技术对家蚕卵、五龄幼虫、蛹、蛾四个不同发育时期及五龄幼虫的不同组织中BmSsu72的转录情况进行分析,发现随着家蚕的生长发育过程,BmSsu72基因的转录逐渐降低,五龄幼虫各个组织中的转录以马氏管和丝腺最高。利用Wester.blotting技术分析家蚕五龄幼虫的气管、丝腺、头、表皮、马氏管、脂肪体、中肠等7个组织中BmSsu72蛋白的分布,发现五龄幼虫的各个组织中均有BmSsu72蛋白的表达,其中以丝腺为最高,推测该蛋白可能和家蚕丝腺分泌相关。用家蚕Bm5细胞对该蛋白进行亚细胞定位,发现BmSsu72蛋白不仅存在于细胞质中,也存在于细胞核中。
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