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细胞色素P450(CYP450)是植物中最大的酶蛋白家族,广泛参与次生代谢产物的生物合成,并对细胞内毒性物质具有降解功能,是研究植物次生代谢和抗逆生理的热点领域之一。苦荞(Fagopyrum tatarium)作为一种食药两用小杂粮,耐贫瘠,抗逆性强,营养丰富,而且富含芦丁等黄酮类化合物。黄酮类化合物属于次生代谢产物,不仅具有多种药理和保健作用,而且广泛参与植物发育和抗逆等多种生理过程,其生物合成途径常需要CYP450单加氧酶类的催化。本研究以苦荞中获得的一条CYP450家族新基因FtP450-R4为材料,通过原核表达和酶活测定,对FtP450-R4的催化性质进行初步分析；通过半定量RT-PCR和黄酮含量的测定,研究逆境对芽期苦荞FtP450-R4基因表达量与黄酮含量的影响。1.采用同源克隆和RACE技术,获得苦荞一条CYP450新ORF序列,长度1527bp,命名为FtP450-R4。ProtParam在线分析结果表明,FtP450-R4可编码508个氨基酸残基,相对分子质量58.4KDa,理论pI7.12,分子式C2652H4129N703O731S25。构建基于CYP450氨基酸序列的系统发育树,结果显示：FtP450-R4蛋白与大豆、拟南芥和葡萄等物种的CYP81家族同属一簇,序列同源性为79%-63%,属于细胞色素P45081家族中的一员。二级结构预测结果表明,FtP450-R4蛋白含有50%的α-螺旋,12.2%的延伸链,3.54%的β-转角和34.25%的无规则卷曲。2.构建pET30b(+)-FtP450-R4重组质粒,在大肠杆菌BL21(DE3)中进行诱导表达,通过酶活测定及薄层层析(TLC)法,分析FtP450-R4的催化性质。结果表明,获得了FtP450-R4蛋白的可溶性表达,分子量约为55KDa,与理论分子量一致；该FtP450-R4蛋白催化反应需要利用NADPH,其酶活为18.85x10-3IU/ml酶液,比活力为1.61×10-3IU/mg; TLC在反应产物中检测到新物质产生。3.在UV-B、寒冷和干旱等逆境胁迫条件下,采用半定量RT-PCR分析芽期苦荞子叶和胚轴中FtP450-R4基因表达量,采用AICl3法测定其总黄酮含量。结果表明,经UV-B和干旱胁迫后2h,子叶中FtP450-R4基因表达量均略有下降,然后迅速上升至95.8%和98.4%,随后剧烈下降至27%和13.9%；经冷胁迫处理后,FtP450-R4基因表达量2h时略有下降,然后迅速上升并稳定在63%-73%。然而,三种胁迫条件下的胚轴FtP450-R4基因表达量虽有小幅波动,但无明显变化,均稳定在37.6%-43.1%。统计学分析显示,UV-B胁迫和干旱胁迫条件下,子叶中FtP450-R4基因表达量与对照差异极其显著(P<0.01),FtP450-R4基因在冷胁迫条件下子叶中的表达量与对照差异显著(P<0.05)；三种逆境下胚轴中FtP450-R4基因表达量都与对照差异不显著(P>0.05)。可见,该基因表达具有组织特异性,且在不同胁迫条件下表达模式有所差异。总黄酮分析表明,芽期苦荞子叶中的黄酮为胚轴的2-6倍；在三种胁迫条件下,子叶和胚轴的总黄酮含量都有所提高。因胁迫条件的不同,胁迫后总黄酮含量变化趋势有所差异。UV-B胁迫能在短时间内(2h)引起芽期苦荞子叶和胚轴总黄酮含量的显著提高(P<0.05)；寒冷胁迫则在长时间(8h)后引起子叶总黄酮的显著提高(P<0.05),在短时间内(2h)引起胚轴总黄酮的显著提高(P<0.05)；干旱胁迫对苦荞子叶总黄酮影响较小(P>0.05),但胚轴对该胁迫响应在处理4h后差异达到最大(P<0.05)。