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漆酶是自然界广泛分布的多铜氧化酶家族中的一个成员,它能氧化一大类酚及非酚类化合物。漆酶广泛存在与植物、昆虫和真菌中,目前在细菌中也有发现。同植物及真菌漆酶比较,细菌漆酶可能比真菌漆酶有更多的优点,如不需糖基化、热力学稳定性好,酶活最适pH广泛等。
本研究根据抗铜特性和使用活性染色方法,从武汉武昌黄金桥山多年生树木根部土壤中筛选到一株具漆酶活力的细菌。凝胶活性染色表明它们都能够氧化漆酶底物DMP和ABTS,但不能氧化酪氨酸。利用16S rDNA序列分析法,结合常规细菌形态学分析,对该株细菌进行鉴定,确定菌株593属于假单胞菌属,将该株细菌命名为Pseudomonas sp.593。Pseudomonas sp.593菌株的漆酶活性需要铜离子的诱导,其铜离子的诱导作用不能被Ca2+、Mn2+、Zn2+、Fe2+、和Mg2+代替。诱导细菌产生漆酶需要在培养基中加入大于5μMCuSO4。当培养基中铜离子浓度超过400μM时,细菌生长变慢,显示高浓度铜离子对细菌生长有抑制作用。活性染色时染色液的pH对该株细菌漆酶的活性有明显的影响。胶内活性染色分析表明,当使用DMP和ABTS作底物,Pseudomonas sp.593在pH 5.0到7.0范围内,都显示酶的氧化活性,并在pH 6.0处显示最强的酶活力。无论是DMP还是ABTS用作底物,对照用的蘑菇粗提液只在pH 4.0左右显示漆酶活力。当pH大于4.5时则不显示酶活性。当分别用4-100℃的不同温度梯度处理该株细菌粗提物30分钟后,在pH 5.0条件下进行DMP胶内活性染色。结果显示：该粗酶液能耐受60℃高温处理。以4℃时的酶活性为100％酶活力。在60℃处理半小时后,仍保持50％以上酶活力。该株细菌粗提物分别在pH 3-10的不同条件下透析20小时,然后在pH 5.0条件下进行胶内DMP-氧化活性染色。pH 6.0-10.0条件下处理,Pseudomonas sp.593细菌漆酶的相对活性在80％以上。使用硫酸铵沉淀、Q-Sepharose层析和凝胶回收方法,对该株细菌进行了初步纯化。部分纯化的细菌漆酶蛋白质经SDS-PAGE分离,估测其蛋白的分子量大约为50kD。
为了该株细菌漆酶的后续研究,本实验在NCBI搜索假单胞菌多铜氧化酶,发现假单胞菌已报道的多铜氧化酶有CopA和CumA两种,利用Blast在GenBank上分别寻找保守氨基酸序列,设计两对简并引物,以Pseudomonas sp.593总DNA为模板进行PCR。结果表明以copA为基础设计的简并引物能够扩增出1475bp片段。PCR产物经测序与Blast分析,发现该片段有四个漆酶特有的铜结合位点,因此判定为部分漆酶基因片段,进一步确定了Pseudomonas sp.593表达漆酶。