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巨细胞病毒属于β-疱疹病毒亚科,在全世界成年人群感染率在60-80%之间。HCMV感染具有严格的种属特异性和终生潜伏感染的重要特点,人是HCMV的唯一宿主。HCMV感染健康人群一般无症状,但是HCMV是导致胎儿出生缺陷的首要感染性病毒,也是导致免疫缺陷人群致病和死亡的重要感染病原体。HCMV先天性感染问题最受人们关注。现在对HCMV感染仍无很理想的治疗措施,因而预防感染显得尤为重要,美国药物协会把研发预防HCMV感染的疫苗确立为最优先的疫苗研发项目,但是至今仍无一种巨细胞病毒疫苗通过批准应用。
HCMV基因组编码二十多种包膜糖蛋白,其中有三个主要的包膜糖蛋白复合体(gCⅠ to-Ⅲ)。gCⅠ复合体是gB(gpUL55)通过二硫键形成的同源二聚体。gH(gpUL75)、gL(gpUL115)、gO(gpUL741)一起组成了gCⅢ复合体,三蛋白之间也是通过二硫键联接。gCⅡ复合体由gM、gN蛋白构成。这些蛋白复合体在病毒吸附、融合和侵入宿主细胞过程中发挥着关键作用,也是自然感染中诱导中和抗体应答的主要靶标。基于研发能阻断病毒侵染的抗HCMV疫苗,这些包膜糖蛋白就成为了首选靶抗原。本文研究了这些蛋白复合体的免疫原性和免疫保护效果。由于包膜糖蛋白大多高度疏水难溶,表达纯化过程中会形成更难溶的多聚体,所以很难直接表达制备蛋白复合体来作为疫苗抗原。DNA疫苗是一种有效的方法来表达膜蛋白复合体而不用在体外表达纯化这些高度难溶又结构复杂的抗原。本论文我们也选择以DNA疫苗的形式来进行免疫研究。
第一章:以综述的形式描述了巨细胞病毒生物学特征及流行情况,病毒感染的致病机制、危害,病毒侵染细胞机制以及CMV疫苗研发现况。
第二章:巨细胞病毒免疫关键包膜糖蛋白DNA疫苗免疫原性比较。制备六种包膜糖蛋白DNA疫苗:gB、gM、gN、gH、gL和gO。50μg剂量通过电击免疫的方式免疫小鼠三次,三免后三周用致死量(5×LD50)的SG-MCMV攻毒小鼠。结果表明六种糖蛋白DNA免疫小鼠都能诱导一定的免疫应答,血清抗体也能中和病毒但效价偏低,都还不能提供小鼠好的保护。gB蛋白是目前已进入临床Ⅲ期研究的候选疫苗,本实验中gB免疫组小鼠保护率为40%。gH、gO和gB蛋白的免疫原性相当,提示gH、gO也可考虑作为CMV疫苗研究的候选靶抗原。gM、gN、gL的免疫原性差于gB蛋白。鉴于包膜糖蛋白疫苗单独免疫保护效果有限,进一步探索了联合免疫策略看能否提高保护效果。
第三章:gCⅢ蛋白复合体(gH/gL/gO)DNA疫苗免疫研究。我们选择gH、gL、gO三基因联合免疫看能否诱导更好的免疫应答,基因间是否存在协同促进作用。实验选取gH/gL、gn/gO、gL/gO、gH/gL/gO联合免疫组合,免疫总剂量仍维持50μg不变。结果表明联合免疫效果显著优于单基因免疫,特别gH/gL/gO免疫两次即能提供小鼠完全保护且小鼠感染后无症状、体重丢失不明显,保护效果可以和灭活疫苗相比。其它两两组合免疫组三次免疫都还不能提供全保护。后续实验发现gH/gL/gO联合免疫降到10μg剂量(gH、gL、gO各3.3μg)免疫两次即能提供小鼠很好的保护。gH/gL/gO共免疫能诱导很好的中和抗体应答和细胞免疫应答。被动免疫实验发现注射了Anti-gH/gL/gO抗血清的小鼠能得到100%的保护,这为开展安全有效的抗血清预防和治疗CMV感染开辟了一条新途径。
第四章:gCⅡ蛋白复合体(gM/gN)DNA疫苗免疫研究。gM是HCMV含量最丰富的糖蛋白,占到病毒净重的10%,和gN蛋白组成复合体参与病毒侵染细胞过程。我们也研究了gCⅡ复合体蛋白的免疫原性。gM、gN或gM/gN各50μg免疫小鼠三次,实验发现gM、gN共免疫较其单独免疫能诱导更好的中和抗体应答和细胞免疫应答。100μg gM/gN联合免疫小鼠三次能提供完全保护,50μg剂量三次免疫还不能提供全保护。实验结果表明gM/gN复合体也可作为抗CMV感染的保护性抗原。
总之,我们的研究表明gCⅡ复合体(gM/gN),特别是gCⅢ复合体(gH/gL/gO)有很好的免疫原性,把它们作为候选抗原来研发HCMV疫苗是可行有效的。