【摘 要】
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干扰素(Interferon, IFN)是一种具有多功效的细胞因子,对多种免疫细胞具有调节作用。由于毕赤酵母表达系统可实现高密度发酵,且其表达产物的生物活性接近天然蛋白,因此本研究
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干扰素(Interferon, IFN)是一种具有多功效的细胞因子,对多种免疫细胞具有调节作用。由于毕赤酵母表达系统可实现高密度发酵,且其表达产物的生物活性接近天然蛋白,因此本研究将利用这一系统来表达鸡γ-干扰素(Chicken interferon gama, ChIFN-γ),为ChIFN-γ的工厂化生产和临床应用打下基础。本研究将编码ChIFN-γ成熟肽的基因克隆至毕赤酵母穿梭表达质粒pPICZaA中,构建重组质粒pPICZaA-IFN-γ。将其线性化后,采用电穿孔法转化到毕赤酵母GS115细胞中。挑取单菌落,先利用YPDS-ZeocinTM平板筛选出高抗性克隆,再通过MMH、MDH平板和PCR方法筛选出2株His+Mut+表型的阳性重组菌株。重组菌株用甲醇诱导可表达出大小约为17kD的重组ChIFN-γ (rchIFN-γ),与天然ChIFN-γ一致；Western blotting表明,rchIFN-γ可与研制的针对ChIFN-γ的特异性多抗血清相结合。经生物信息学分析,毕赤酵母表达的rchIFN-γ的等电点约为pH5.2,因此采用超滤浓缩、透析和DEAE阴离子交换层析来纯化表达产物。经SDS-PAGE鉴定,纯化产物的纯度约为70%。DF1-VSV系统检测结果表明,纯化后的rchIFN-γ具有较强的抗病毒活性,效价达10,240IU/mL。以rchIFN-γ为佐剂与H9亚型禽流感灭活疫苗联合免疫SPF鸡,研究rchIFN-γ是否对疫苗的免疫应答具有增强效果。经流式细胞术检测,使用rchIFN-γ试验鸡的外周血中CD4+T淋巴细胞相对百分含量以及CD4+/CD8+比值显著高于未使用rchIFN-γ的试验鸡(p<0.05)。通过血凝抑制试验检测疫苗免疫后试验鸡血清中的HI抗体水平,并于免疫后35天用H9亚型禽流感病毒进行攻击,检测各组鸡的排毒情况。结果表明：在疫苗接种后的第14天,使用rchIFN-γ试验鸡的HI抗体效价达到高峰,早于未使用rchIFN-γ的试验鸡达到高峰；且使用rchIFN-γ试验鸡的HI抗体效价显著高于未使用rchIFN-γ的试验鸡(p<0.05)；H9亚型禽流感病毒攻击后,使用rchIFN-γ的试验鸡排毒率显著低于未使用rchIFN-γ的试验鸡(p<0.05)。以上试验结果表明,rchIFN-γ在体内外均有良好的生物学活性,并可能作为疫苗佐剂在生产上得到应用。
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