土壤是人类赖以生存的主要自然资源之一，也是人类生态环境的重要组成部分。工业“三废”和机动车尾气的排放、污水灌溉及农药、除草剂和化肥的大量使用，造成了日益严重的土壤重金属污染，并进一步通过食物链危及人类健康。植物修复技术(phytoremediation)是利用重金属超富集植物吸收土壤中的重金属离子并累积到地上部，通过收获植物地上部来清除土壤重金属污染的绿色生态技术。因此，筛选重金属耐性/富集植物，分离鉴定耐性/富集相关基因，探讨植物对重金属的吸收、转运、解毒和富集等方面的生理与分子机制，并利用基因工程技术培育重金属高耐性超累积物种，对于植物修复重金属污染土壤以及最终改善粮食作物的重金属危害具有广阔的应用价值及实践意义。　　 本文以重金属超富集模式植物印度芥菜(Brassica juncea L.)和遏蓝菜(Thlaspicaerulescens)为研究对象，分别从抗氧化保护酶系统和离子转运蛋白系统两方面进行了相关基因的初步研究，并同时建立了一种农杆菌介导的重金属超富集植物遏蓝菜的遗传转化方法。　　 一、重金属超富集植物耐受/富集相关基因的克隆及其功能分析　　 利用mRNA荧光标记差异显示技术和差异显示文库筛选技术从重金属超富集植物印度芥菜和遏蓝菜中克隆到Cd胁迫上调表达的三个基因，分别为BjCAT3，TcCET和TcVDAC，并分别利用不同方法进行了功能研究。　　 BjCAT3编码过氧化氢酶，其二级结构高度保守。转录水平分析表明BjCAT3特异的在印度芥菜叶部表达，并且受到寒、旱、盐以及重金属胁迫的诱导。构建BjCAT3正义与反义双子叶表达载体并转化印度芥菜，过量表达BjCAT3印度芥菜的CAT活性是野生型印度芥菜的1.5～2.5倍，而抑制BjCAT3表达的印度芥菜CAT活性只有野生型的50％，且生长状况较差，对重金属抗性降低。35S∷BjCAT3基因转化烟草品种NC89，子代转基因烟草的CAT活性水平高达野生型的2.5倍。Cd胁迫下的烟草表型分析表明，过量表达BjCAT3可以显著提高转基因烟草的Cd抗性，减轻Cd胁迫造成的受伤症状。转基因烟草中H2O2以及MDA的含量明显低于野生型植株，根部细胞活力检测表明，过量表达BjCAT3可以明显减轻Cd诱导的细胞死亡。以上结果说明过氧化氢酶在植物抵抗重金属胁迫，清除重金属胁迫产生的过量ROS，保护细胞膜稳定，维持细胞正常生理功能的过程中发挥着重要作用。　　 TcCET编码的蛋白质为典型的金属阳离子转运蛋白(Cation Diffusion Facilitator,CDF)家族成员，拓扑结构和序列特征分析表明该蛋白含有1个完整的N端特征标签序列，1个C端阳离子输出域和6个跨膜结构域™。RT-PCR分析表明，TcCET在遏蓝菜根茎叶中均有表达，但在叶部的表达量显著高于根部。Northern blotting和RT-PCR结果显示，TcCET可被二价重金属离子诱导表达，且随时间增加呈现先上升又回落的表达趋势。以双缺陷型酵母zrcl&cotl为表达系统，构建酵母表达载体。重金属抗性实验结果表明，在施加了不同浓度Zn/Cd/Ni/Co的培养基上，转TcCET基因酵母生长状况明显好于对照。重金属含量测定表明，50μM ZnCl2，20μM CdCl2，500μM NiCl2，40μM CoCl2处理后，转TcCET基因酵母中的Cd，Ni，Co的富集量显著低于对照转化空载体酵母，而Zn的富集量高于对照。过量表达TcCET能够显著提高转基因烟草在重金属胁迫下的愈伤分化，植株再生及其生根能力。重金属含量测定表明，过量表达TcCET的转基因烟草地上部Zn和Cd的富集量显著高于野生型烟草。说明TcCET在植物富集重金属过程中发挥了重要的作用。　　 TcVDAC编码一个电压依赖性阴离子通道蛋白(Voltage-dependent anionchannels，VDAC)，其二级结构高度保守，不同物种间VDAC相似性可高达92％。TcVDAC含5个内含子，以单拷贝形式存在于遏蓝菜基因组中。Northern blotting分析表明，该基因在植物体各器官均有表达并且受重金属诱导。原核表达抗性分析表明，重组菌中TcVDAC的过量表达可明显提高细菌对Zn/Cd/Co/Ni的抗性。酵母耐受实验表明，转化TcVDAC基因可不同程度的提高酵母的重金属抗性，推测酵母中TcVDAC的过量表达可以更好的维持线粒体膜的稳定性，防止细胞色素c和细胞凋亡因子的释放，减轻重金属引发的细胞凋亡，其具体作用机制尚需进一步补充和完善。　　 二、农杆菌介导的重金属超富集植物遏蓝菜的遗传转化　　 遏蓝菜是一种著名的Zn/Cd超富集植物，在植物修复技术的应用及重金属耐性/富集相关基因的筛选上具有重要价值。我们构建了双子叶转化载体pBI121，以卡那霉素为筛选抗生素，GUS为报告基因，建立了农杆菌介导的遏蓝菜的遗传转化体系。在实验室已有的遏蓝菜快繁基础上，我们优化激素成分及配比得到具快速分化能力的转化外植体。通过抗生素测试得到合适的用于筛选转化植株的卡那霉素浓度，并确定了最佳的侵染菌液浓度及共培养时间。通过GUS染色和PCR分析获得阳性植株，进一步通过RT-PCR以及Southem blotting技术验证了转基因遏蓝菜中外源基因(bjCAT3)转录水平的成功表达以及T-DNA的插入方式，酶活性检测表明，转基因植株中的CAT活性远远高于对照野生型植株。以上结果说明了遏蓝菜遗传转化方法成功建立，为该物种的生物量改良及应用提供了科学依据。