论文部分内容阅读
唾液酸是九碳链带有负电荷的α酮酸唾液酸,唾液酸参与多种生理和病理过程,例如细胞间通讯、信号转导、细菌和病毒感染以及癌症转移等。唾液酸转移酶催化了唾液酸从胞嘧啶核苷酸(CMP-Sia)转向受体,是生理和病理中重要唾液酸及其相关分子的合成中的关键酶。由细菌中得到的唾液酸转移酶由于其灵活的底物特异性以及在大肠杆菌中的高效的表达被广泛用于合成各种各样的包含唾液酸的结构。唾液酸转移酶GT80(Pm0106)在保守的DDG模体中141位包含一个自然突变DY,这个突变同样存在GT52和所有GT80家族中,而且证明是没有活性的。除此之外,一条位于Pm0106活性中心的氢键链(Asp141-Asn109-Asp33)的结构被证明在四中GT80唾液酸家族都是保守的。为探究141位突变以及氢键链对Pm0106酶活性的作用,分别设计了Pm0106突变株Y141D、M144D141D、D141N、D141N-N109D、D141N-N109D-D33N、N109A141D、D33A141D以及D33L141D。以pET-15b为载体,NdeI和Xho I为酶切位点,通过双酶切建立重组质粒。通过突变PCR得到各个突变株,转化E.Coli BL21(DE3),0.1mmol/L IPTG诱导表达产生分别产生各个突变株蛋白,用SDS-PAGE分析,检测蛋白浓度。建立高效液相色谱法检测各个突变株酶反应活性,质谱检测反应产物,通过建立不同PH反应体系,HPLC分析各个产物峰,得到最适合反应的pH。用薄层层析技术检测Y141D,N109A141D以及D33A141D经过45℃、50℃处理30min后酶反应活性,比较各个突变株的稳定性以及不同构象的底物对反应的影响。分析Pm0106酶活反应分别得出Y141D 1/80,M144D141D1/80,N109A141D1/80时反应产物与剩余底物之间的比例较合适,D141N,D33A141D,D33L141D以一倍浓度时反应较合适,而D141N-N109D,D141N-N109D-D33N反应活性较低几乎检测不到反应。通过HPLC检测,计算产物峰与原料峰的比例,在缓冲液为pH达8.0时反应程度达到最大值,由此推测此反应缓冲液的最适pH为8.0。通过薄层层析可知无论是以aLac还是β-Lac为受体,野生型Pm0160都没有活性,而突变株Y141D,M144D141D,N109A141D,D33A141D,D33L141D以及对照PmST1都有较好的反应活性,突变株D141N,D141N-N109D,D141N-N109D-D33N没有反应活性。在经过45℃处理30min后Y141D,N109A141D以及D33A141D的活性都减小,而50℃处理30min后Y141D保留很小的活性,N109A141D和D33A141D的活性丧失。本研究表明Pm0106唾液酸转移酶反应的最适pH为8.0其DDG模体中141位天冬氨酸作为广义碱,是维持唾液酸转移酶活性必须的,由141位天冬氨酸以及邻近的109位天冬酰胺形成的氢键对于维持蛋白结构稳定性有不可缺少的作用,而33位天冬氨酸和39位丙氨酸之间位于的螺旋在调节酶活性方面也起了一定作用。