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背景肺癌是全球最常见的一种恶性肿瘤,其发病率和死亡率均居恶性肿瘤之首,在组织病理学分型中约80-85%属于非小细胞肺癌。以第一代表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂（epidermal growth factor receptortyrosine kinase inhibitor,EGFR-TKI）吉非替尼为代表的分子靶向药物对晚期EGFR突变的非小细胞肺癌具有显著的临床疗效,但大部分患者在接受治疗约1年左右,均不可避免的产生获得性耐药。研究证实,第一代EGFR-TKIs的耐药机制主要是EGFR基因第20号外显子上T790M的突变（占总突变比例60%）,其他的耐药机制包括旁路激活、下游信号激活、小细胞转化及上皮-间质转化（英文全称,EMT）等,但仍有约30%的耐药机制不明。尽管第三代EGFR-TKIs奥希替尼被批准用于EGFR突变的晚期NSCLC一线治疗及吉非替尼、厄洛替尼等获得性耐药后的二线治疗,但因其价格等因素,第一代EGFR-TKIs依然是我国EGFR突变的晚期NSCLC主要治疗方案。因此,深入研究吉非替尼的耐药机制并研发防治其耐药的治疗手段具有重要的临床意义。近年来研究发现,microRNA（miRNA）在肿瘤发生发展及耐药方面有着重要的作用。miRNA是一类长度约为19-25nt的内源性非编码RNA,可通过与目的mRNA碱基互补抑制或降解靶基因,广泛参与基因转录后的表达调控活动。在恶性肿瘤的发生发展过程中,它既能以癌基因的方式参与肿瘤细胞的增殖、凋亡抵抗、侵袭、转移以及肿瘤微血管的形成,又能以抑癌基因的角色参与诱导肿瘤细胞凋亡。在NSCLC中,miRNA不仅影响着肺癌的发生发展及预后转归,还调控着EGFR突变的NSCLC对EGFR-TKIs的敏感性。课题组在前期研究中应用miRNA芯片发现miR-221在吉非替尼获得性耐药的肺癌细胞中显著高表达。既往研究发现,miR-221在NSCLC患者组织的表达水平异常升高,且与NSCLC的侵袭转移以及预后密切相关;miR-221可以诱导肝癌对索拉非尼的耐药,诱导乳腺癌对曲妥珠单抗的耐药,那么miR-221是否参与EGFR-TKIs的耐药,具体作用机制是什么,目前尚不明确。目的探讨miR-221诱导PC-9肺癌细胞对吉非替尼耐药的作用及机制。方法应用慢病毒空载对照（LV-NC）和LV-miR-221转染PC-9细胞并建立细胞稳转株PC-9/NC和PC-9/miR-221。荧光定量PCR法检测稳转细胞株中miR-221的相对表达量;应用CCK-8法检测吉非替尼（04μmol/L）对细胞生长增殖的影响;应用Caspase-3酶活性实验检测吉非替尼对细胞Caspase-3酶活性的影响;流式细胞术检测吉非替尼对细胞凋亡的影响;荧光定量PCR法和免疫荧光法检测凋亡酶激活因子-1（APAF-1）mRNA和APAF-1蛋白相对表达量;双荧光素酶报告基因实验检测APAF-1与miR-221的关系;Western印迹检测表皮生长因子受体（EGFR）及其磷酸化EGFR（p-EGFR）和APAF-1、剪切的半胱氨酸/天冬氨酸蛋白水解酶（Cleaved-caspase-3）蛋白相对表达量。结果1.荧光定量PCR结果显示:PC-9/NC细胞中miR-221的相对表达量显著低于PC-9/miR-221细胞[（1.00±0.082）比（40.24±0.017）]（P<0.01）。2.CCK-8结果显示:PC-9/NC细胞半数抑制浓度(IC50)显著低于PC-9/miR-221细胞[(IC50=0.1μmol/L)比（IC50>4μmol/L）)]（P<0.05）。3.Caspase-3酶活性检测结果显示:与PC-9/NC对照组相比,加入吉非替尼后,PC-9/NC细胞的OD值为（0.33+0.02）,PC-9/miR-221的OD值为（0.18+0.03）,即加入吉非替尼后PC-9/NC的caspase-3酶活性高于PC-9/miR-221 caspse-3酶的活性,两组相比,差异显著（P<0.01）。4.流式细胞术结果显示:PC-9/NC细胞凋亡率显著高于PC-9/miR-221细胞[（33.42±4.28）%比（10.27±1.12）%]（P<0.05）。5.荧光定量PCR结果显示PC-9/NC细胞中APAF-1mRNA的表达量显著高于PC-9/miR-221细胞中[（1.000+0.069）比（0.701±0.072）]（P<0.05）;免疫荧光结果示:PC-9/NC细胞中APAF-1蛋白的相对表达量明显高于PC-9/miR-221细胞。6.双荧光素酶结果示:共转染荧光素酶质粒pmir-REPORT-APAF-1-wt和miR-221a模拟物后,miR-221a抑制荧光素酶活性显著高于转染miRNA阴性对照组（P<0.01）。7.Western blot结果示:吉非替尼均可下调PC-9/NC和PC-9/miR-221细胞中的p-EGFR,PC-9/miR-221细胞中APAF-1、Cleaved-caspase-3蛋白明显低于PC-9/NC细胞,吉非替尼上调PC-9/NC细胞中的APAF-1、Cleaved-caspase-3等促凋亡蛋白表达水平显著高于PC-9/miR-221细胞（P<0.05）。结论miR-221可能通过下调APAF-1表达,抑制细胞凋亡的产生,从而诱导PC-9细胞对吉非替尼耐药。