金黄色葡萄球菌是一种革兰氏阳性致病菌,可引起野生动物多种危及生命的疾病。头孢喹肟对金黄色葡萄球菌具有强效的抗菌活性,为探究其与耐药金黄色葡萄球菌选择性富集的关系及耐药性产生的网络机制,本试验采用体外PK/PD模型研究头孢喹肟不同给药方案下耐药性产生和富集的关系,同时对耐药菌差异表达蛋白进行定量性测定、筛选和分析,以初步阐明其对头孢喹肟的耐药机制。本试验以头孢喹肟精制品、金黄色葡萄球菌ATCC6538为材料,具体步骤如下:1构建体外PK/PD模型,模型采用消除半衰期为2.5 h或5 h时,给药间隔12 h或24 h时3 μg/mL、5 μg/mL、10 μg/mL不同给药浓度的方案给药。每周期运行时长为72 h,期间于不同时间点采集模型内肉汤样品用于药物浓度和细菌含量的测定。2利用含药平板筛选同一给药方案下首先出现2 MIC耐药的低浓度耐药株、8 MIC耐药的高浓度耐药株与标准敏感菌株进行Labelfree定量蛋白质组学试验(n=3)。通过GO分析、KEGG通路富集分析、PPI网络分析,筛选出差异表达蛋白及论证其相互关系,以便更好的了解耐药菌的进化历程和耐药相关蛋白的网络作用机制。研究结果和结论如下:1体外条件下,头孢喹肟对金黄色葡萄球菌ATCC6538的最小抑菌浓度(MIC)为0.50μg/mL,抑制99%细菌浓度(MIC99)为0.40μg/mL,防突变浓度(MPC)为1.60μg/mL,突变选择窗(MSW)范围为 0.40～1.60μg/mL。2在模拟动物体内不同给药方案下,耐药突变存在着如下规律,在给药间隔和消除半衰期相同的情况下,给药浓度越高,出现耐药菌的时间越早:给药浓度和消除半衰期相同的情况下,给药间隔越长,耐药菌出现越早;给药间隔和给药浓度相同的情况下,消除半衰期越短,耐药菌产生的越早。耐药程度呈累积性增长,随着给药时间的延长,耐药程度逐级升高。在药物浓度高到一定值时,细菌会被全部杀死。且即使再提高药物浓度,也不能加快杀灭细菌的速度。3当头孢喹肟在各类动物临床给药时,药物浓度高于MPC的时间占给药间隔时间的百分比(%T>MPC)≥50%时,既有良好的抗菌活性,又能抑制耐药性的发生。4采用Labelfree定量蛋白质组学技术在S.aureus中共鉴定到蛋白质2065个。根据GO功能注释发现三组菌株差异表达蛋白主要存在于细胞和细胞膜上,参与代谢进程和细胞内进程,具有催化活性和结合活性。KEGG通路分析进一步确认差异表达蛋白显著富集的通路中共有102个相关蛋白。具体涉及10个KEGG信号通路:核糖体通路、抗万古霉素通路、赖氨酸生物合成通路、丁酸甲酯代谢通路、柠檬酸循环通路、核黄素通路、氧化磷酸化通路、乙醛酸-二羧酸代谢通路、谷胱甘肽代谢通路、硫胺素代谢通路。耐药程度不同的菌株间差异表达蛋白显著富集的代谢通路不完令一致,各通路间也存在着网络关联。PPI分析从各通路中得到11个枢纽蛋白显著表达上调,腺苷酸激酶枢纽蛋白显著表达下调,这为金黄色葡萄球菌对头孢喹肟耐药靶点的研究提供了重要的参考候选蛋白。综上所述,头孢喹肟在模拟动物体内不同给药方案中对金黄色葡萄球菌耐药性的产生时间和富增程度都有影响,维持药物浓度高于MPC的时间占给药间隔时间的百分比大于或等于50%时,抗菌活性良好并能抑制耐药性的发生。金黄色葡萄球菌在耐药性进化时,菌体内的多种通路会共同作用互相关联来对抗药物带来的生存压力。总之,本试验为野生动物临床感染金黄色葡萄球菌后的合理给药提供了一定的参考依据,并初步阐明了耐药性产生的网络机制。