论文部分内容阅读
骨髓间充质干细胞(MSCs)是修复损伤心肌的理想干细胞，但其在缺血缺氧微环境下的低存活率已成为MSCs临床应用的瓶颈。Netrin-1是一种神经介导蛋白，近年来发现其在心血管方面的重要作用，Netrin-1可以促进心肌和内皮细胞一氧化氮(NO)的分泌，在心肌梗死中保护心脏，而且Netrin-1对MSCs的增殖和迁移有促进效果。本研究通过逆转录病毒转导使MSCs过表达Netrin-1基因，在RNA和蛋白水平上检测Netrin-1基因的表达，NO的分泌量以及Netrin-1-MSCs的增殖和迁移能力，评估Netrin-1对MSCs的影响。注射Netrin-1-MSCs到大鼠心肌梗死部位，完成心肌坏死面积，胶原含量及心脏功能等方面的研究。
用贴壁法从大鼠腿骨中分离培养骨髓间充质干细胞，在细胞传代至三代的时候能得到较纯的MSCs。成功构建pMSCV-Netrin-1-IRES-GFP质粒，并通过双酶切和PCR进行鉴定。用磷酸钙法包装含有目的基因Netrin-1的逆转录病毒，高效转导大鼠间充质干细胞。用流式细胞仪检测Netrin-1基因转导百分率，可达到60％以上。
采用RT-PCR及Western blot在RNA水平和蛋白水平上检测到MSCs中Netrin-1的过表达。用NO试剂盒检测过表达Netrin-1基因MSCs的NO分泌水平，发现Netrin-1-MSCs的NO分泌水平较MSCs有显著提高(P<0.05)，通过MTT实验和损伤分析实验，发现Netrin-1-MSCs的增殖速度和迁移能力与MSCs相比有明显提高。
我们建立了大鼠心肌梗死模型，将200-230g大鼠心脏左前降支冠状动脉永久结扎，然后向心肌中注射1×106个Netrin-1-MSCs。动物分组为4组：1.假手术组(n=5)；2.心肌梗死+生理盐水注射(n=9)；3.心肌梗死+MSCs注射(n=5)；4.心肌梗死+Netrin-1-MSCs注射(n=7)。30天后，处死动物，取出心脏样品切片进行分析。通过H&E染色和Masson’s染色检测，发现Netrin-1-MSCs组较之盐水组心肌损伤面积和胶原含量得到显著改善，通过vWF和isolectin免疫染色，发现Netrin-1-MSCs组较之盐水组血管再生的情况显著改善，与MSCs组相比也有一定程度的改善，通过WGA免疫染色发现Netrin-1-MSCs组较之盐水组和MSCs组心肌肥大的情况均得到显著改善。
在心血管领域，首次引入Netrin-1基因，将其应用于心脏疾病的治疗研究。本研究将转基因技术与干细胞技术相结合，利用骨髓干细胞取材方便，又可以分化成心肌细胞帮助心肌修复的功能，同时结合Netrin-1可以促进细胞增殖迁移，减少细胞凋亡，释放NO保护心肌等特点，为心肌梗死的治疗开辟新途径。相信随着研究的深入，Netrin-1在心脏中的保护作用和相关调节将会逐渐变得清晰，为疾病临床治疗提供新的思路与希望。