论文部分内容阅读
人类8型疱疹病毒(human herpesvirus8,HHV-8)也称卡波西肉瘤相关疱疹病毒(Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus,KSHV),是艾滋病患者最常见并发症-卡波希肉瘤的致病原。与其它疱疹病毒类似,HHV-8感染也会经历潜伏和裂解周期,潜伏向裂解复制的转换由HHV-8开放阅读框(open reading frame,ORF)50基因编码的复制与转录激活蛋白(replication and transcription activator,RTA)来控制。RTA可以通过与靶基因启动子上的RTA应答原件(RTA responseelement,RRE)直接结合而激活下游病毒基因的转录,这些下游基因包括PAN、K2、K9、K14、ORF37、ORF52、ORF56和ORF57基因等。病毒的ORF57基因编码一个称为mRNA转录物积累蛋白的病毒早期核蛋白,是控制病毒复制从早期到晚期转换的关键。ORF57启动子中的40 bp区段(nt81904-81943)介导RTA的转录激活。在此区段中已发现两个富含AT的RTA应答元件,分别称为RRE1和RRE2,其中RRE1与病毒K8启动子序列同源,而RRE2不仅结合RTA,还能结合宿主编码的干扰素调节因子7(interferon regulatory factor7,IRF-7)。RTA和IRF-7对RRE2的竞争影响RTA对ORF57启动子的转录激活,并调控病毒的活化。在RRE1和RRE2之间有一个7 bp的重组信号序列结合蛋白Jκ(recombination signal-bindingprotein Jκ RBP-Jκ)识别位点,可能参与RTA与RRE的结合。
为研究HHV-8 ORF57启动子40 bp区段中的各元件对RTA和IRF-7的应答,以及寻找该区段外新的IRRE,本文利用上游引物1-5和下游引物6或7扩增ORF57启动子片段,分别插入到pGL3-basic载体来构建系列缺失型报告质粒S1-S5和L1-L5,它们分别包含ORF57启动子中从nt81556,81904,81918,81930或81944到转录起始位点1(nt82003)或转录起始位点2(nt82081)之间的序列。此外还对元件进行不同组合构建出报告质粒C1-C8,以检测应答元件的数目和距离对RTA激活和IRF-7抑制的影响。以S1-s5报告质粒单独转染或与RTA和IRF-7表达质粒共转染293T细胞,测定萤火虫荧光素酶活性,发现RRE1对于RTA的转录激活非常关键,缺失RRE1的报告质粒对RTA几乎没有应答。用同样方法检测L1-L5报告质粒,发现缺失RREl的报告质粒仍保留对RTA和IRF-7的应答,直至进一步缺失掉RBP-Jκ位点才彻底丧失对RTA和IRF-7的应答能力。比较S系列与L系列报告质粒的转染结果发现,在两个转录起始位点之间,即nt82003和82081之间的78 bp区段中可能存在一个新的功能性RRE,它能介导RTA的转录激活,还能弥补由于缺失RRE1造成的对RTA应答的缺失。我们将这个新鉴定的功能性RRE命名为RRE4,对其精确位置和作用机制还有待于进一步深入的研究。共转染IRF-7表达质粒发现,IRF-7除了能有效抑制RRE1介导的RTA激活外,还能抑制RRE4介导的RTA激活,暗示IRF-7对临近RRE的抑制不表现出方向性。C1-C8报告质粒的转染结果显示,增加RRE1的数目对RTA的激活作用无显著影响,但是增加RBP-Jκ位点的数目不仅使RTA的激活得到增强,且RTA的激活作用不能被IRF-7所抑制。反之,缺失RBP-Jκ位点的报告质粒对RTA几乎没有应答,暗示RBP-Jκ位点在介导RTA激活ORF57启动子方面的关键作用。通过改变应答元件之间的距离发现,轻微加大RRE1与RBP-Jκ位点的距离并不影响RTA的转录激活和IRF-7的抑制作用,说明40 bp区段是可分的。但是,RBP-Jκ位点与RRE2之间的距离显著影响RTA的转录激活,人为缩短或加大二者之间距离的报告质粒都不再具备对RTA的应答能力。本文的工作阐明了启动子中应答元件的数目和距离对病毒基因表达的影响,为研究病毒和宿主蛋白对病毒基因表达的精密调控机制奠定了基础。此外,本文还利用非变性凝胶电泳的方法观察到IRF-7的二聚体形式。