论文部分内容阅读
研究目的:本研究旨在探讨蛋白质精氨酸甲基化转移酶5(protein arginine methyltranserase 5,PRMT5)对肝癌细胞增殖、迁移、侵袭等生物学行为的影响,并初步阐明其促进上皮间质转化(epithelial mesenchymal transition,EMT)作用的分子机制,为进一步的临床应用研究提供理论基础。研究方法:Western Blot、qPCR检测不同肝癌细胞中PRMT5蛋白质及mRNA的表达水平;利用慢病毒介导的RNAi技术,构建PRMT5 shRNA干扰质粒sh-PRMT5,并进行慢病毒包装,感染肝癌细胞,嘌呤霉素筛选得到能稳定低表达PRMT5的肝癌细胞株,Western Blot、qPCR检测干扰效率。将PRMT5过表达质粒pHA-PRMT5瞬时转染稳转细胞株以恢复其PRMT5的表达。用CCK-8法检测PRMT5对肝癌细胞增殖能力的影响,平板克隆形成实验检测PRMT5对肝癌细胞克隆形成能力的影响,Transwell迁移实验检测PRMT5对肝癌细胞迁移能力的影响,Transwell侵袭实验检测PRMT5对肝癌细胞侵袭能力的影响,来评价PRMT5对肝癌细胞生物学行为的影响。Western blot检测PRMT5对侵袭相关指标MMP2和MMP9蛋白表达量的影响,及上皮间质转化相关指标E-cadherin、Collagen-I、β-catenin、α-SMA、Vimentin和SNAIL的蛋白水平的变化,免疫荧光及蛋白质核浆分离实验检测肝癌细胞中SNAIL亚细胞定位的变化,初步探明PRMT5促进EMT的分子机制。研究结果:结果表明:PRMT5特异性shRNA慢病毒载体构建成功。肝癌细胞株SMMC-7721、BEL-7402中PRMT5表达量相对较高。PRMT5特异性shRNA慢病毒载体构建成功。慢病毒包装并感染SMMC-7721、BEL-7402细胞株,Western blot、q PCR检测结果表明PRMT5 shRNA慢病毒载体sh-PRMT5在肝癌细胞中具有沉默效率。靶向沉默PRMT5的表达后,肝癌细胞的增殖能力、克隆形成能力、迁移能力、侵袭能力减弱,MMP2和MMP9的蛋白表达水平下降,E-cadherin和SNAIL蛋白表达水平增加,Collagen-I、β-catenin、α-SMA和Vimetin蛋白表达水平下降;过表达PRMT5可以部分增强肝癌细胞的增殖能力、克隆形成能力、迁移能力、侵袭能力,提高MMP2和MMP9的蛋白表达水平和Collagen-I、β-catenin、α-SMA、Vimetin和SNAIL蛋白表达水平,降低E-cadherin蛋白表达水平。免疫荧光及蛋白质核浆分离实验结果表明,靶向沉默PRMT5的表达后,肝癌细胞中SNAIL由细胞核穿梭至细胞质中,而恢复稳转细胞中PRMT5的表达后,SNAIL又重新回到细胞核中。研究结论:PRMT5促进了肝癌细胞的增殖、迁移和侵袭等生物学行为;其通过调控SNAIL的亚细胞定位促进了肝癌细胞的上皮间质转化。