“梨锈水病”病原菌的鉴定及分子生物学分析

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梨锈水病是我国梨树上一种新的细菌性病害,最早在江苏徐淮地区发现,近年在浙江、山东、德州也有发生。该病发展迅速,为害性大,常引起植株枝干产生锈水状溃疡,叶片产生褐色斑点,最终整株枯死(王能友,2006)。本文以这种病害为研究对象,开展了梨锈水病病原菌鉴定及其基本生物学特性研究、特异性引物设计等工作,得到以下主要结果:1.对分离菌进行培养性状、过敏性试验、色素分泌观察和接种实验检测。结果显示,共有58个分离菌株,均无菌株存在色素分泌现象,36个菌株有烟草过敏性反应。将所有菌株在浙江的德清和鸬鸟地区梨树上进行接种后,以js4、js5、js6、js7为代表的30个分离菌株发病症状与自然发病症状完全一致,并且从接种病株上重新分离到了此病原细菌,此30个分离菌株经柯赫氏法则证明均为该病的病原菌。各菌株致病力无明显差异。2.对这些菌株进行了分子生物学鉴定。将上述30个病原菌株,通过分子检测等手段,扩增所分离菌株的16S、rDNA-ITS序列区和测序,通过Genbank数据库比对,结果显示,30个病原菌株与Dickeya chrysanthemi序列相似性分别为97%和96%,2个菌株与Erwinia pyrifoliae.序列相似性为99%。构建系统发育树显示,梨锈水病病原菌与Dickeya属其他种有一定的差异性,应为Dickeya属的一个新种。3.特异性引物的构建。通过扩增rDNA-ITS序列区和比对,设计出梨锈水病病原菌的特异性引物,经过特异性引物检测、灵敏度检测和实际样品检测验证等步骤,能够快速准确的将分离菌株同Dickeya chrysanthemi区分开来。曾有专家指出,我国发生的梨锈水病病原菌实为检疫对象梨火疫或者亚洲梨火疫病原(商明清,1992);另外由于本病害已经被前人检测为Erwinia属(邱文等,2010),但是具体为Erwinia属的哪一个种,一直以来均无相关报道(Hauben. L. et al.,1998),至今尚无定论。针对以上两点质疑,我们对其进行进一步的鉴定分类,明确了梨锈水病的病原菌种类以及分类现状,同时在分子水平上构建了梨锈水病病原菌的检测方法,为今后开展梨锈水病的防治工作奠定一定的基础。
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