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研究背景: 近几十年来肺癌的发病率、死亡率逐渐上升,肺癌已经取代肝癌成为世界上恶性肿瘤死亡原因的第一位[1,2]。在我国,肺癌的发病率和病死率都呈逐年增长的趋势[3]。目前,对于肺癌来说最有效的治疗手段仍然是手术治疗,无法行手术治疗的肺癌患者只能接受化疗、放疗或靶向治疗等[4-7]。但初诊肺癌病人仅有20~30%左右可以接受手术,70~80%为中晚期病人则失去根治手术机会。部分根治性治疗以及大多数中晚期病人姑息性治疗后,最终都会因为癌症复发、转移或耐药而不能控制肿瘤导致疾病进展,这都是肺癌患者高死亡率的重要原因。因此,寻找肺癌预后的相关指标对治疗方案的选择和提高患者生存率具有很大的意义。 HGF/MET信号通路作为肿瘤转移的重要机制之一,近来在肿瘤领域逐渐开展了越来越多的科学研究。首先,HGF作为 HGF/MET信号通路激活的配体,对信号的启动有至关重要的作用,但它在非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)影响及其作用机制仍有许多空白。其次,最近研究表明[8-12],HGF与 c-Met可能相互促进,并可以通过各种交叉通路对话影响肿瘤的侵袭和转移。因此,我们探讨探究了HGF对肺癌的影响及其发生作用的分子机制,并进一步探讨HGF在NSCLC的表达及其预后作用。 研究目的: 探讨 HGF在肺癌细胞的表达及其对肺癌细胞侵袭转移的作用以及分子机制,并进一步探讨 HGF在 NSCLC的表达与临床病理因素的关系及其对预后的影响,为寻找预测肺癌预后的标志物提供实验数据。 研究方法: 1.细胞体外培养:实验室下培养包括 A549及其耐药株 A549/DDP,耐药细胞株需要DDP维持。 2.以A549及其耐药株A549/DDP为细胞研究对象,培养并提取细胞总RNA,并RT-PCR法检测HGF在细胞中的表达水平。 3.Western blot法检测HGF及EMT标志蛋白的表达:根据mRNA的表达水平验证A549、A549/DDP细胞经HGF处理前后的HGF、c-Met及EMT标志蛋白的表达变化。 4. RT-PCR法检测并验证过表达HGF前后癌细胞中HGF、MET、EMT相关基因的变化。 5.细胞划痕实验(Cell wound scratch assay):细胞划痕实验检测外源性添加HGF刺激诱导前后A549、A549/DDP细胞的迁移能力。 6.细胞侵袭迁移实验(Transwell assay)检测过表达HGF前后的侵袭能力的变化。 7.免疫组织化学法(Immunohistochemistry,IHC):以IHC法检测HGF、MET蛋白在人体肺癌组织中的表达情况。 8.统计学方法:采用SPSS13.0以及GraphPad Prism6 Demo软件进行统计分析,实验数据以均数±标准差表示,组间比较采用t检验分析,多样本比较应用单因素方差分析。检验水准仅=0.05。P<0.05为差异有统计学意义。 研究结果: 1.实时荧光定量RT-PCR检验HGF在细胞株的表达情况: RT-PCR检测HGF在NSCLC细胞株A549与A549/DDP中的表达水平,结果显示,HGF在A549/DDP细胞中的表达水平显著高于其在A549细胞中的表达水平,A549/DDP细胞HGF的表达水平是A549细胞的(2.82±0.23)倍(P<0.05)。 2.细胞迁移侵袭实验(划痕实验与Transwell): 2.1细胞划痕实验显示,在划痕24 h后,A549/DDP细胞划痕的宽度分别为A549细胞划痕宽度的(81±2.4)%;在划痕48h后,,A549/DDP细胞划痕的宽度分别为A549细胞划痕宽度的(63±2.2)%,有统计学意义(P<0.05)。外源性增加A549及A549/DDP微环境中HGF水平,显示HGF过表达后A549/DDP较低表达的A549细胞划痕愈合能力强。 2.2 Transwell实验结果显示,A549/DDP、A549细胞微环境中增加 HGF水平实验组较未增加 HGF水平的对照组的侵袭细胞数分别为(230±9.6)个/视野、(161±11.5)个/视野和(175±10.4)个/视野、(45±7.5)个/视野,差异均有统计学意义(均P<0.01)。实验显示HGF过表达可促进肿瘤细胞侵袭能力。 3.Western blot和RT-PCR检测HGF对A549/DDP和A549细胞中EMT标志蛋白(vimentin、E-cadherin)表达的影响: 3.1Western blot检测结果显示,HGF、vimentin、E-cadherin在A549/DDP、A549细胞表达存在差异,HGF、vimentin在A549/DDP较A549表达增高,E-cadherin在A549/DDP较A549表达减少;增加A549/DDP及A549细胞微环境中HGF水平可刺激细胞vimentin增加、E-cadherin减少,差异具有统计学意义(P<0.05)。肺癌细胞可能通过表达并释放HGF,增加微环境中HGF水平,通过调控上皮-间质转化促进肿瘤的侵袭转移。 3.2 RT-PCR检测HGF对A549/DDP和A549细胞中EMT标志蛋白mRNA的影响,结果显示 HGF、vimentin、E-cadherin标志蛋白 mRNA在 A549/DDP、A549细胞表达存在差异,HGF、vimentin在A549/DDP较A549表达增高,E-cadherin在A549/DDP较A549表达减少;维持A549/DDP及A549细胞微环境中HGF水平可刺激细胞vimentin增加、E-cadherin减少,差异具有统计学意义(P<0.01)。 4. IHC检测HGF在NSCLC患者肿瘤组织的表达情况: IHC结果显示,HGF主要表达于肿瘤细胞浆和胞膜,偶见细胞质棕色颗粒染色,细胞核无表达。NSCLC组织中HGF蛋白高表达比例为62.5%(40/64)。HGF在肺癌组织中表达,与肿瘤分化程度(P<0.05)、远处转移(P<0.05)、淋巴结转移(P<0.05)、TNM分期(P<0.01)明显相关,与性别、年龄、家族史、吸烟史、瘤直径、肿瘤组织淋巴细胞浸润无明显相关。Spearman分析表明HGF与c-MET表达正相关。生存分析显示HGF高表达较低表达者中位生存期短,有相对较差的预后趋势,但P值未达到统计学意义,可能是影响肺癌预后的因素之一。 结论: 1. HGF可以促进肺癌细胞的侵袭和迁移。 2. HGF能够通过调控 EMT,可能促进肺癌转移。 3. HGF的表达与肺癌的分化、转移、TNM分期有显著的临床相关性。 4. HGF可能作为肺癌预后的一个分子标志物。