【摘 要】
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γ-聚谷氨酸（γ-poly glutamic acid,γ-PGA）是一种由谷氨酸单体通过γ-酰胺键连接起来的氨基酸多聚体,拥有极强的吸水性以及生物可降解等特性,能够被应用于各个方面。但γ-PGA的应用与其相对分子质量息息相关,不同相对分子质量的γ-PGA特性和应用范围不同,所以对γ-PGA的相对分子质量进行调控是必要的。本文筛选了一株暹罗芽孢杆菌HJ-3作为γ-PGA生产菌,并从发酵条件和体外酶
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γ-聚谷氨酸（γ-poly glutamic acid,γ-PGA）是一种由谷氨酸单体通过γ-酰胺键连接起来的氨基酸多聚体,拥有极强的吸水性以及生物可降解等特性,能够被应用于各个方面。但γ-PGA的应用与其相对分子质量息息相关,不同相对分子质量的γ-PGA特性和应用范围不同,所以对γ-PGA的相对分子质量进行调控是必要的。本文筛选了一株暹罗芽孢杆菌HJ-3作为γ-PGA生产菌,并从发酵条件和体外酶降解两方面调控γ-PGA相对分子质量,主要研究内容如下:（1）本文筛选了一株γ-PGA高产菌株HJ-3,其遗传特性稳定,能够用于发酵生产γ-PGA。通过观察菌种HJ-3的菌体形态、生理生化实验结果、16S rDNA和gyrB基因测定及系统进化树分析确定了菌株HJ-3为Bacillus siamensis,以前未见暹罗芽孢杆菌生产γ-PGA的报道,本研究属于首次发现暹罗芽孢杆菌生产γ-PGA。暹罗芽孢杆菌HJ-3基础发酵试验表明其为谷氨酸非依赖型菌株,但在培养基中添加谷氨酸钠能够大幅度提高γ-PGA产量。（2）选择不同发酵条件研究其对暹罗芽孢杆菌发酵生产γ-PGA的影响。选择不同温度（33℃、35℃、37℃、39℃、41℃）探究其对γ-PGA相对分子质量影响,发现在33℃条件下暹罗芽孢杆菌能够生产高分子量的γ-PGA;在35℃条件下生产低分子量γ-PGA。但是在33℃和35℃温度条件下γ-PGA产量太低,因此不建议使用温度调控γ-PGA相对分子质量;选择不同pH（6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5）考察其对γ-PGA相对分子质量影响,发现pH在6.0-8.5范围内,pH值越小,γ-PGA相对分子质量越大,说明能够通过pH调控γ-PGA相对分子质量;选择不同表面活性剂（SDS、X-100、CTAB、吐温80）探究其对γ-PGA相对分子质量影响,发现添加表面活性剂对γ-PGA相对分子质量影响不大;选择不同氯化钠浓度（2.5%、5%、7.5%、10%）考察其对γ-PGA相对分子质量影响,发现随着氯化钠添加量的上升γ-PGA相对分子质量先升高后降低,但始终高于对照,添加量为5%时γ-PGA相对分子质量最高。（3）从发酵条件实验中发现添加氯化钠适合调控γ-PGA相对分子质量,进一步考察探究钠盐（硝酸钠、硫酸钠、氯化钠、碳酸钠、亚硫酸钠）以及氯盐（氯化铵、氯化钾、氯化镁、氯化钙）对γ-PGA相对分子质量调控作用。结果表明钠盐中对γ-PGA相对分子质量影响最大是硫酸钠,而氯化钠和硝酸钠对其影响基本相似;氯盐中氯化钠和氯化钾趋势相同,但钾离子比钠离子影响大。并且低浓度的无机盐都能降低γ-PGA相对分子质量,高浓度无机盐能够抑制低相对分子质量γ-PGA的合成进而提高γ-PGA相对分子质量。（4）从基因组测序以及蛋白比对分析中得到暹罗芽孢杆菌HJ-3中γ-PGA代谢途径相关酶,包括谷氨酸消旋酶、合成酶以及降解酶,其中Pgds降解酶对γ-PGA相对分子质量影响较大,因此异源表达暹罗芽孢杆菌HJ-3中Pgds降解酶,验证其功能并体外调控γ-PGA相对分子质量,发现暹罗芽孢杆菌HJ-3中Pgds降解酶能够降解小分子量的γ-PGA,所以能够使用Pgds降解酶来生产高分子量γ-PGA。综上所述,本研究以暹罗芽孢杆菌HJ-3作为γ-PGA生产菌株,属于谷氨酸非依赖型γ-PGA生产菌,添加谷氨酸钠后产量能够大幅提高。可以通过发酵条件调控暹罗芽孢杆菌生产γ-PGA的相对分子质量,其中无机盐比较适合调控γ-PGA的相对分子质量,添加不同浓度的无机盐调控暹罗芽孢杆菌生产不同相对分子质量的γ-PGA;并且能通过暹罗芽孢杆菌HJ-3中Pgds降解酶在体外降解低分子量γ-PGA以获取高分子量的γ-PGA。
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