目的:结直肠癌在全球范围内的发病率较高且患者预后较差。越来越多的证据显示传统中药可发挥有效的抗肿瘤效应。毛蕊异黄酮是从传统中药黄芪中提取的单体成分,有研究表明它具有一定的抗肿瘤活性。本研究拟以结直肠癌细胞HCT-116、SW480为对象,在体外较为系统地评价毛蕊异黄酮对结直肠癌的治疗效应,并在体外初步探索毛蕊异黄酮发挥该治疗效应的分子机制,进一步构建SW480裸鼠移植瘤模型,在体内评价毛蕊异黄酮对结直肠癌的治疗效应。方法:体外,培养结直肠癌细胞HCT-116及SW480至约80%融合度后将细胞接种于细胞培养板中,待细胞贴壁后加入一系列不同浓度的毛蕊异黄酮(6.25μM、12.5μM、25μM、50μM、100μM、200μM、400μM)处理细胞48h,采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)试验探究毛蕊异黄酮对HCT-116、SW480细胞增殖的影响。加入不同浓度的毛蕊异黄酮(50μM、100μM、200μM)处理细胞48h后,采用流式细胞术检测毛蕊异黄酮对HCT-116、SW480细胞凋亡及细胞周期的影响;采用划痕试验探索毛蕊异黄酮对HCT-116、SW480细胞迁移能力的影响;采用蛋白印迹试验检测毛蕊异黄酮对HCT-116、SW480细胞胞内信号蛋白的影响。体内,采用Balb/c裸鼠经皮下注射100μl SW480单细胞悬液构建裸鼠移植瘤模型,当肿瘤体积达到80-100mm~3时,表明造模成功。造模成功后,将20只裸鼠分为对照组和毛蕊异黄酮低、中、高剂量治疗组,每组5只裸鼠,毛蕊异黄酮治疗组裸鼠腹腔注射毛蕊异黄酮(20,40,60mg/kg),对照组裸鼠腹腔注射相应体积的生理盐水。将对照组肿瘤体积达到1000 mm~3的时间设为实验终点,采用称量肿瘤质量的方式探索毛蕊异黄酮对移植瘤生长的影响;采用组织切片及苏木精-伊红(HE)染色探索毛蕊异黄酮对移植瘤分化的影响。结果:1.6.25μM、12.5μM、25μM、50μM、100μM、200μM、400μM的毛蕊异黄酮对HCT-116细胞的增殖抑制率分别为7%、12%、15%、22%、35%、40%、72%,对SW480细胞的增殖抑制率分别为6%、9%、12%、20%、28%、40%、62%。提示在体外毛蕊异黄酮可以剂量依赖的方式抑制结直肠癌细胞HCT-116及SW480增殖,毛蕊异黄酮剂量越高,增殖抑制率越高。2.0μM、50μM、100μM、200μM毛蕊异黄酮处理后的HCT-116细胞中凋亡细胞所占的比例分别约为10%、18%、25%、45%,SW480细胞中凋亡细胞所占的比例分别约为15%、26%、35%、44%。以0μM毛蕊异黄酮处理组为阴性对照组,50μM毛蕊异黄酮处理组中凋亡细胞的比例显著高于阴性对照组(P<0.05),随着毛蕊异黄酮给药剂量的逐渐增加,相应处理组中凋亡细胞的比例也逐渐增加(P<0.01)。提示毛蕊异黄酮以剂量依赖的方式诱导HCT-116及SW480细胞凋亡。3.0μM、50μM、100μM、200μM毛蕊异黄酮处理后的HCT-116细胞中G0/G1期细胞所占的比例分别约为41%、50%、55%、65%,SW480细胞中G0/G1期细胞所占的比例分别约为52%、58%、68%、72%。以0μM毛蕊异黄酮处理组为阴性对照组,50μM毛蕊异黄酮处理组中G0/G1期细胞所占的比例显著高于阴性对照组(P<0.05),随着毛蕊异黄酮给药剂量的逐渐增加,相应处理组中G0/G1期细胞所占的比例也逐渐增加(P<0.01)。提示毛蕊异黄酮以剂量依赖的方式阻滞HCT-116及SW480细胞的细胞周期在G0/G1期。4. 毛蕊异黄酮以剂量依赖的方式抑制HCT-116及SW480细胞迁移,毛蕊异黄酮剂量越高,迁移抑制能力越强。5.0μM、50μM、100μM、200μM毛蕊异黄酮处理后的HCT-116细胞中雌激素受体β(estrogen receptorβ,ERβ)的相对表达量约为0.31、0.39、0.60、0.80,同源性磷酸酶(PTEN)的相对表达量约为0.32、0.38、0.57、0.78,磷酸化的蛋白激酶B(p-Akt)的相对表达量约为0.8、0.6、0.4、0.3。以0μM毛蕊异黄酮处理组为阴性对照组,100μM、200μM毛蕊异黄酮处理组中ERβ及PTEN的水平均显著高于阴性对照组(P<0.01)。而50μM、100μM、200μM毛蕊异黄酮处理组中p-Akt的水平均显著低于阴性对照组(P<0.01)。0μM、50μM、100μM、200μM毛蕊异黄酮处理后的SW480细胞中ERβ的相对表达量约为0.28、0.36、0.52、0.68,PTEN的相对表达量约为0.32、0.40、0.60、0.82,p-Akt的相对表达量约为0.75、0.62、0.32、0.21。50μM毛蕊异黄酮处理组中ERβ及PTEN的水平均显著高于阴性对照组(P<0.05),而p-Akt的水平显著低于阴性对照组(P<0.05),随着毛蕊异黄酮给药剂量的逐渐增加,相应处理组中ERβ及PTEN的表达水平逐渐增加(P<0.01),Akt的磷酸化水平逐渐降低(P<0.01)。提示毛蕊异黄酮以剂量依赖的方式上调HCT-116及SW480细胞ERβ及PTEN的表达水平,抑制Akt的磷酸化。6. 对照组、低、中、高剂量毛蕊异黄酮治疗组中肿瘤的平均质量约为1.5g、1.3 g、1.1 g、0.9 g。中等剂量毛蕊异黄酮即可显著抑制移植瘤生长(P<0.05),高剂量毛蕊异黄酮对移植瘤的生长抑制效应更强(P<0.01)。提示在体内毛蕊异黄酮可以剂量依赖的方式抑制SW480移植瘤的生长。7. 毛蕊异黄酮可以剂量依赖的方式促进肿瘤组织分化,随着用药剂量的逐渐增加,肿瘤组织中的异形核细胞逐渐减少,且在60mg/kg毛蕊异黄酮治疗组中可见肿瘤组织中出现明显的腺样结构。结论:上述研究结果证实毛蕊异黄酮在体外可抑制结直肠癌细胞增殖、促进结直肠癌细胞凋亡、导致结直肠癌细胞周期阻滞、抑制结直肠癌细胞迁移。且在体外它可能是通过与肿瘤细胞表面的ERβ相互作用并上调ERβ的表达,同时上调PTEN的表达抑制Akt的磷酸化来发挥相关作用的。在体内毛蕊异黄酮可抑制肿瘤生长并促进肿瘤组织分化。本研究可为开发以毛蕊异黄酮为对象的抗结直肠癌药物奠定实验基础。