研究背景及意义原发性肺癌是全世界发病率最高的恶性肿瘤之一,几十年来其发病率在世界各地均呈现出持续上升的趋势,是目前全世界恶性肿瘤致死的最主要原因。肺癌具有发病隐匿和进展迅速的特点,一般临床发现较晚,在恶性肿瘤导致的死亡中,肺癌居首位。尽管在肺癌的根治性手术,放疗、化疗等综合性治疗中取得了较大进展,但患者的生活质量和生存时间均无法令人满意。随着对肿瘤分子机制研究的不断深入,人们逐渐意识到恶性肿瘤的发生发展是一个多因素,多步骤,多基因共同参与的复杂的演变过程。肿瘤的生物治疗和基因治疗成为肿瘤治疗研究的热点和新希望。肿瘤的生长和转移过程高度依赖于丰富的新生血管提供营养,肿瘤血管生成是指肿瘤细胞诱导的微血管生长及肿瘤微环境中血液循环的建立,在恶性肿瘤的生长、侵袭和转移等过程中发挥了极其重要的作用,并由此提出了抑制肿瘤生长的新途径—抗肿瘤血管生成治疗。肿瘤血管生成是一个极其复杂和协调的过程,受多因子不同层次的调控。抗血管生成治疗,以肿瘤的新生血管为作用靶点,通过切断肿瘤的营养供应和转移路径,阻止肿瘤的生长、侵袭和转移,是一种重要的靶向治疗方法。血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)和缺氧诱导因子la (hypoxia inducible factor-1α, HIF-1α)在肿瘤血管生成过程中的作用至关重要。利用免疫组织化学技术将新生血管内皮细胞染色,并通过染色计算微血管密度(microvessel density, MVD)为公认的评估肿瘤血管生成的金标准。本研究以CD34蛋白标记血管内皮细胞,计数MVD。Retinoblastoma binding protein 2 (RBP2)作为JARID蛋白家族的新成员,其组蛋白去甲基化酶的活性能够使发生三或二甲基化的组蛋白H3的第四个赖氨酸位点(H3-K4)去甲基化。RBP2可以通过抑制多种靶基因的转录,进而调控细胞的分化。然而,RBP2与pRB结合后,就由转录抑制子变成了转录激活子。最近的研究表明,RBP2蛋白通过与整合素β1 (ITGBβ1)的启动子结合进而调控肺癌的侵袭和转移等恶性生物学行为,另有研究发现RBP2蛋白通过激活Akt信号通路上调N-cadherin和Snail的表达水平进而促进肺癌的侵袭和迁移,而ITGBβ1和Akt信号通路可以调控VEGF等下游分子的表达参与肿瘤血管生成。因此,RBP2蛋白可能在恶性肿瘤血管生成过程中扮演重要角色。侵袭和转移是恶性肿瘤导致患者死亡的主要原因,也是恶性肿瘤治疗领域中一直尚未解决的难题,恶性肿瘤发生侵袭转移涉及肿瘤细胞之间黏附力的降低、肿瘤细胞与基底膜的紧密附着、细胞外基质的降解、肿瘤细胞侵入血管或淋巴管、黏附于内皮细胞而停留在远隔部位、向外侵袭并诱导血管生成、逃避宿主抗肿瘤反应并在转移部位继续生长。从理论上讲,阻断上述多阶段连续过程中的任何一个环节就有可能阻断恶性肿瘤细胞的侵袭和转移。因此,研究恶性肿瘤侵袭转移的分子机制及其相应的治疗策略具有极其重要的意义。基质金属蛋白酶9(matrix metalloproteinase-9, MMP-9)是锌离子依赖性的蛋白水解酶,能够降解破坏肿瘤原发位点的细胞外基质和基底膜,使恶性肿瘤细胞从缺口处发生侵袭和转移。Thimet oligopeptidase (THOP1)是一个由77个氨基酸组成的具有HEXXH锌离子结合结构域的金属内肽酶,参与多种肽类激素和神经肽(长度为5-17个氨基酸的短肽)的代谢,包括缓激肽、促性腺激素释放激素、阿片肽和神经降压素等。较早的研究发现THOP1在大脑、垂体和性腺等富含神经肽的组织中高表达,随着研究的进展,发现THOP1在人类多种肿瘤组织和正常组织的细胞浆、内质网、线粒体和细胞核中均有表达。最近的研究发现肝癌周围正常组织中THOP1 mRNA高表达的患者生存率显著高于mRNA低表达的患者。另外,黑素瘤细胞中THOP1可以抑制由缓激肽诱导的肿瘤细胞增殖和血管生成。这些结果表明THOP1可能是一个潜在的抗肿瘤治疗剂。第一部分RBP2蛋白与非小细胞肺癌血管生成及预后的相关性研究目的检测Ⅰ期非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)组织中RBP2蛋白、HIF-1α蛋白、VEGF蛋白和CD34蛋白的表达情况,结合患者的临床病理资料和术后随访资料进行相关的统计分析,研究RBP2蛋白表达与患者临床病理特征、肿瘤血管生成及预后的相关性。探讨RBP2蛋白表达对NSCLC细胞体外促血管形成能力的影响及其相关分子机制。方法收集在2006年1月至2008年12月在山东大学齐鲁医院胸外科行肺癌切除加系统性淋巴结清扫的102例Ⅰ期非小细胞肺癌患者的组织标本,采用免疫组化方法检测RBP2蛋白、HIF-1α蛋白和VEGF蛋白的表达,抗CD34抗体标记肿瘤组织内的微血管内皮细胞,并计数MVD。应用SPSS 17.0软件建立数据库并进行统计分析。卡方检验分析RBP2蛋白、MVD与患者临床病理指标之间的关系,Kaplan-Meier法绘制患者的生存曲线,Log-rank检验比较患者的生存差别,Cox回归多因素分析判定独立的预后因素。采用western blot检测BEAS2B、SK-MES-1、A549、 SPCA-1和H1975中RBP2蛋白的表达水平,以脂质体2000作为转染试剂,将特异性沉默RBP2基因的siRNA转染入RBP2基因表达水平最高的H1975细胞株内,将特异性过表达RBP2基因的pcDNA3-HA-RBP2转染入RBP2基因表达水平最低的SK-MES-1细胞株内。体外内皮细胞成管实验检测细胞促血管形成能力的变化。酶联免疫吸附试验检测各不同处理组细胞的上清液中VEGF的表达水平。Real-time PCR检测处理的细胞中HIF-1α和VEGF mRNA表达水平的变化,western blot检测处理的细胞中RBP2蛋白、HIF-la蛋白、VEGF蛋白、Akt蛋白(?)p-Akt蛋白表达情况的变化。结果1.在102例Ⅰ期NSCLC标本中,有52例RBP2蛋白呈高表达,占总病例数的51%。应用卡方检验比较RBP2蛋白表达与患者不同临床病理指标的相关性,结果显示：RBP2蛋白高表达与肿瘤的T分期(P=0.030)、HIF-1α蛋白高表达(P=0.028)及VEGF蛋白高表达(P=0.048)密切相关,而与患者的年龄、性别、吸烟史、肿瘤组织类型及分化程度均无显著的相关性(P>0.05)。2.102例Ⅰ期NSCLC标本中MVD计数范围为6.4～102,其中高MVD者46例,占总病例数的45.1%。卡方检验比较MVD与患者不同临床病理指标的相关性,结果显示：高MVD与HIF-1α蛋白高表达(P=0.034)及VEGF蛋白高表达(P=0.001)密切相关。3. Mann-Whitney U test分析结果显示：NSCLC组织中RBP2蛋白高表达与高MVD计数密切相关(P=0.033)。4. Kaplan-Meier分析的结果显示：RBP2蛋白高表达患者的5年生存率显著低于RBP2蛋白低表达的患者(53.8% vs 72.0%,P=0.037)；高MVD患者的5年生存率显著低于低MVD的患者(52.2% vs 71.4%, P=0.040)。Cox多因素分析的结果表明RBP2蛋白高表达是影响患者预后的独立因素(P=0.044)。5. Western blot检测RBP2蛋白在非小细胞肺癌细胞株SK-MES-1, A549,SPCA-1和H1975高于支气管上皮细胞BEAS2B,其中,RBP2蛋白在H1975细胞表达最高,在SK-MES-1细胞表达最低。RBP2-siRNAl和RBP2-siRNA2均能显著抑制H1975细胞中RBP2蛋白的表达；pcDNA3-HA-RBP2能显著增加SK-MES-1细胞中RBP2蛋白的表达。上述结果表明RBP2-siRNA1、RBP2-siRNA2和pcDNA3-HA-RBP2均可用于后续的RBP2蛋白体外功能的实验研究。6.由RBP2沉默的H1975细胞(siRNA1:12.33+3.06,siRNA2:9.67+1.53)产生的条件培养基促HUVECs形成管状结构的能力显著低于对照组(38.67+2.52,P<0.01)。7. ELISA结果显示RBP2沉默(siRNA1:0.99±0.11 ng/ml, siRNA2:0.94±0.14 ng/ml)的H1975细胞产生的条件培养基中VEGF的水平显著低于对照组(1.87±0.10 ng/ml,P<0.01)。另外,在加入VEGFR：抑制剂舒尼替尼苹果酸盐(2.5μM)后,阴性对照组产生的条件培养基促HUVECs形成管状结构的能力显著降低(10.33+2.22,P<0.01)；在加入VEGF-165 (2 ng/ml)后,干扰组产生的条件培养基促HUVECs形成管状结构的能力显著提高(41.03+3.25,P<0.01)。8.常氧条件下RBP2蛋白激活HIF-1α蛋白的表达具有时间依赖性,峰值出现在转染后36小时。在H1975细胞中沉默RBP2蛋白的表达引起HIF-1α蛋白和VEGF蛋白表达降低,在SK-MES-1细胞中过表达RBP2蛋白引起HIF-1α蛋白和VEGF蛋白表达升高。9.RBP2蛋白通过激活HIF-1α蛋白的表达促进了VEGF的表达。10.RBP2蛋白通过PI3K/Akt信号通路激活HIF-1α蛋白的表达。VEGF可以激活由RBP2调控的p-Akt的表达,提示Akt和VEGF之间可能存在一个回馈循环。结论本研究结果表明RBP2高表达与高MVD在Ⅰ期NSCLC组织中普遍存在,RBP2高表达与NSCLC肿瘤大小、HIF-1α高表达、VEGF高表达和高MVD密切相关。RBP2蛋白高表达与患者术后生存期密切相关,为影响Ⅰ期NSCLC患者预后的独立因素。在常氧条件下,RBP2蛋白通过PI3K/Akt信号通路增强HIF-1α和VEGF的表达,在NSCLC的血管生成过程中可能发挥重要作用,此外,VEGF可以激活由RBP2调控的p-Akt的表达,提示Akt和VEGF之间可能存在一个回馈循环。本研究的结果显示RBP2蛋白可能成为抗非小细胞肺癌血管生成治疗的新靶第二部分THOP1蛋白与非小细胞肺癌侵袭转移及预后的相关性研究目的检测THopi蛋白在NSCLC组织中的表达水平,探讨THOP1蛋白表达与患者各临床病理指标、术后肿瘤复发及预后的相关性。采用RNA干扰技术特异性抑制NSCLC细胞内THOP1蛋白的表达,探讨THOP1蛋白表达与NSCLC细胞体外侵袭及迁移能力的相关性。方法收集2006年1月到2007年12月在山东大学齐鲁医院胸外科行肺叶切除加系统性淋巴结清扫的NSCLC患者的组织标本,其中,NSCLC组织标本120例,正常肺组织53例(距肿瘤边缘5厘米以上)。应用免疫组化方法检测THOP1蛋白的表达。应用SPSS 17.0软件建立数据库并进行统计分析。卡方检验分析THOP1蛋白与患者临床病理指标之间的关系,Kaplan-Meier法绘制患者的生存曲线,Log-rank检验比较患者的生存差别,Cox回归多因素分析判定独立的预后因素。采用Real-time PCR和western blot检测肺癌组织、正常肺组织和非小细胞肺癌细胞株中THOP1 mRNA和蛋白的表达水平。将siRNA转染入A549细胞株内特异性沉默THOP1基因。细胞划痕实验检测细胞迁移能力的变化；’Trans well侵袭实验检测细胞侵袭能力的变化；明胶酶谱检测细胞培养上清液中MMP-9活性的变化。结果1.在120例NSCLC组织标本中有49例表现为THOP1蛋白高表达,高表达率为40.8%,在53例正常肺组织标本中有31例表现为THOP1蛋白高表达,高表达率为58.5%。THOP1蛋白在正常肺组织中的高表达率显著高于NSCLC组织(卡方检验,P=0.032)。 NSCLC组织标本中THOP1蛋白低表达与肿瘤淋巴结转移显著相关(P=0.048),而与患者其他临床病理指标无显著相关性(P>0.05)。采用Real-timePCR和western blot检测16名患者的NSCLC组织标本及其相应正常肺组织,结果显示,NSCLC标本中THOP1 mRNA和蛋白的表达水平均显著低于正常肺组织。2.单因素生存分析结果显示,THOP1蛋白低表达的患者,其术后5年的无病生存率(P=0.038)和总生存率(P=0.017)均分别显著低于THOP1蛋白高表达的患者。另外,有淋巴结转移的患者(29.0% vs 50.0%,P=0.025)以及TNM分期较晚的患者(30.1% vs 53.2%,P=0.009)其术后5年的总生存率均显著降低。Cox回归多因素分析的结果显示,THOP1蛋白低表达分别是判定患者无病生存率(P=0.046)和总生存率(P=0.021)的独立预后因素。3. THOP1蛋白在A549、H1299、SPCA-1和H322M等4种NSCLC细胞株中存在不同程度的表达,H1299细胞THOP1的表达水平最高。选取H1299细胞进行RNA干扰实验。THOP1-siRNA1和THOP1-siRNA2均能显著抑制H1299细胞中THOP1蛋白的表达,阴性对照组的Control siRNA对RBP2蛋白的表达无明显影响。4.抑制H1299细胞内THOP1蛋白的表达,划痕实验结果显示细胞的迁移能力显著增高(P<0.01)。5.抑制 H1299细胞内THOP1蛋白的表达,Transwell侵袭实验结果显示细胞的侵袭能力显著增高(P<0.01)。6.抑制 H1299细胞内THOP1蛋白的表达,明胶酶谱实验结果显示细胞培养上清液中MMP-9的活性显著增高(P<0.01)。结论THOP1蛋白在正常肺组织的表达水平显著高于NSCLC组织,THOP1蛋白低表达与肺癌术后复发及不良预后密切相关；检测THOP1蛋白蛋白的表达水平可作为判定患者不良预后的参考指标。采用RNA干扰技术抑制THOPl蛋白的表达,H1299细胞的迁移、侵袭能力显著增强,明胶酶谱结果显示THOP1蛋白可能是通过调控MMP-9的活性影响H1299细胞的侵袭转移过程。THOP1蛋白可能成为抗非小细胞肺癌侵袭转移治疗的新抗肿瘤剂。