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萎蔫短小杆菌糖甜菜致病变种(Curtobacterium flaccumfaciens pv. Beticola, cfb)是引起糖甜菜(Beta vulgaris var. saccharifera)叶斑病的主要病原物。依据该病原菌的16S-23S rRNA ITS区(登陆号为AY191513)在特异性位点用Primer Premier 5.0设计了一对引物CfbF(5′-TCAGTGCTGGTCGCCCATTAG-3′)和CfbR(5′-AACAACGTGCACCAGCCAGC A-3′)，预计PCR扩增产物为191 bp。用该引物扩增3个cfb菌株及29个参比菌株，仅靶标菌扩增出191 bp产物；在实时荧光定量PCR检测体系中，靶标菌株都检测到较强的信号，熔解曲线为单峰，没有非特异性扩增。为建立标准曲线将靶标基因组DNA稀释为0.001 ng，0.01 ng，0.1 ng，1 ng，10 ng共5个梯度，进行实时荧光PCR扩增。回归方程为y=-0.2741x+7.51，R~2=0.99。菌株Tc7(Pseudomonas spp)是从发病糖甜菜上分离到的另一病原细菌，用16S rRNA通用引物(16sF：5′-ATTGAACGCTGGCGGCAGGCCT-3′和16sR：5′-TCCCCTACGGTTACCTTGTTA-3′)扩增其16S rRNA并测序，经比对发现其与Pseudomonas argentinensis、Pseudomonas flavescens、Pseudomonas fulva等多个菌株的16S rRNA序列同源性都很高，几乎不存在特异性位点。用已报道的真细菌ITS通用引物U1／U2扩增该菌株16S-23S rRNA间的ITS，测得420 bp序列(已登陆至GenBank数据库，登录号为EF205021)，在多态性较为丰富的区域设计引物PF(5′-AGGCGCTCAAGCAAATCATAGA-3′)和PR(5′-TTGTTCCCAATCACGTAGGGTG-3′)，预计PCR扩增产物为238 bp。常规PCR验证引物特异性，除靶标菌株外其余29个参比菌株均无扩增产物。在实时荧光定量PCR检测体系中，靶标菌株扩增曲线平滑，熔解曲线主峰明显，表明没有非特异性扩增。将靶标基因组DNA依次稀释10倍，成0.00084 ng，0.0084 ng，0.084 ng，0.84 ng，8.4 ng，84 ng共6个梯度，阴性对照为灭菌超纯水。每个处理做两个重复，制备标准曲线。每两个重复的曲线基本重合，Ct值也十分相近，表明重复性较好。标准曲线的回归方程为y=-3.33x+20.42，R~2=0.99。该方法适用于糖甜菜叶片上病原物的检测。茄青枯菌(Ralstonia solanacearum)能够引起多种重要作物萎蔫症状，是一类重要的的病原菌。本研究用J. Schonfeld等人报道的引物Rsol_fliC建立了对该菌的实时荧光定量PCR(SYBR GreenⅠ)检测体系，并制作标准曲线，回归方程为y=-3.74x+44.15，R~2=0.96。